GDF11PRO-Fc sitoutuu sekä gdf11: een että MSTN: ään

osoittaakseen, että gdf11pro-FC pystyy eristämään aktiivisen kypsän GDF11-dimeerin suoran vuorovaikutuksen kautta, pyrimme tunnistamaan proteiini-proteiini-vuorovaikutuksen gdf11: n ja gdf11pro-FC: n välillä. Lisäksi GDF11: n ja mstn: n kypsien dimeerien tiiviin rakenteellisen homologian vuoksi halusimme myös selvittää, liittyykö GDF11PRO-Fc mstn: ään. Tunnistaaksemme nämä proteiini-proteiini-vuorovaikutukset suoritimme joukon pull-down-määrityksiä(Kuva. 1). Ligandit rGDF11, rMSTN ja rActivin a inkuboitiin hek293-solujen lysaattifraktioilla, jotka transfektoitiin plasmidilla, joka koodaa gdf11pro-Fc: tä tai MPRO-Fc: tä pH: ssa 7,4. Muunnetuissa propeptideissä olevien konjugoituneiden Fc-fraktioiden vuoksi fraktiot voitiin vetää suoraan A / G-proteiinin agaroosihartsiin. Gdf11pro-Fc kaatoi odotetusti sekä rGDF11: n että rMSTN: n, mikä osoitti, että GDF11PRO-Fc pystyi sitomaan molemmat ligandit. Lisäksi MPRO-Fc onnistui kaatamaan sekä rGDF11: n että rMSTN: n. Sekä GDF11PRO-Fc että MPRO-Fc eivät pystyneet poistamaan kaukaisempaa sukua olevaa TGF-β superperhettä ligandi rActivin A: ta, mikä osoittaa, että ligandien sitoutuminen on spesifistä (Kuva. 1). Gdf11pro-Fc: n, MPRO-Fc: n, rGDF11: n, rMSTN: n tai rastiviini A: n ei havaittu sitoutuvan kontrolliagaroosihartsiin, jossa ei ole proteiinia A/G. Näistä tuloksista päätellään, että GDF11PRO-Fc assosioituu spontaanisti kypsien GDF11-ja MSTN-dimeerien kanssa fysiologisessa pH: ssa.

GDF11PRO-Fc associates with GDF11 and mstn. Proteiini-proteiini-interaktiot gdf11pro-Fc: n tai MPRO-Fc: n ja rGDF11: n, rMSTN: n tai rastiviini A: n välillä määritettiin vetokokeella. GDF11PRO-Fc: tä tai MPRO-Fc: tä inkuboitiin rgdf11: llä, rMSTN: llä tai rastiviini A: lla 1 tunnin ajan 4 °C: ssa. Fc-fuusioituneet proteiinikompleksit erotettiin A / G-proteiinipäällysteisellä agaroosihartsilla ja eluaatit johdettiin 12%: n SDS-sivuisella geelillä pelkistävissä olosuhteissa ja tutkittiin western blotilla. Syöttöohjaus oli 5% syöttömateriaalista. WB western blot

GDF11PRO-Fc-lohkot GDF11/MSTN-indusoitu atrofia C2C12 myotuubeissa

Rgdf11: n ja rMSTN: n lisäämisen erilaistuneisiin myotuubeihin on aiemmin osoitettu aiheuttavan atrofiaa hiiren c2c12: ssa ja ihmisen primaarisessa luustossa MYOTUBET . Selvitettyämme, että GDF11PRO-Fc sitoo GDF11: tä ja MSTN: ää, kysyimme seuraavaksi, voisiko GDF11/MSTN: n aiheuttama myotube-atrofia eriytyneissä c2c12-myotubeissa estää gdf11 / mstn: n. Tämän saavuttamiseksi pakkasimme GDF11PRO-Fc: lle koodaavan DNA-sekvenssin AAV6 capsidiin tuottamaan AAV6-GDF11PRO-Fc-vektorin. Näissä kokeissa AAV6-vektori valittiin, koska se kykenee tehokkaasti ja selektiivisesti muuntamaan erilaistuneita c2c12-myotubeja, mutta ei myoblasteja . C2C12 myoblasteja viljeltiin ja erilaistettiin 5 päivän ajan ennen aav6-GDF11PRO-Fc-tai AAV6-EGFP-hoitoa (kontrollivektori), jolloin MOI oli 105 (Kuva. 2 a). Kuten odotettiin, GFP-ekspressio oli havaittavissa C2C12-myotubeilla, jotka oli infektoitu AAV6-EGFP: llä 48-72 tunnin kuluttua tartunnasta, ja sisäistettyjen vektorigenomikopioiden kvantifiointi diploidista genomia kohti 72 tunnin kuluttua tartunnasta osoitti, että vektorien transduktio oli riittävästi saavutettu (Kuva. 2b ja c).

GDF11PRO-Fc estää GDF11 / MSTN: n aiheuttaman myotube-atrofian c2c12-soluissa. kaavamainen yksityiskohtaisesti kokeellinen aikajana c2c12 myotubes. AAV6-EGFP tai AAV6-GDF11PRO-Fc lisättiin c2c12 myotubeihin 105: n MOI 5.päivänä erilaistumisen jälkeen ja 100 ng/ml rGDF11 tai rMSTN lisättiin 7. päivänä. Myotubet värjättiin ja analysoitiin 10.päivänä. b EGFP: n ilmentyminen todettiin 48-72 tunnin kohdalla C2C12-myotubeilla, joita hoidettiin AAV6-EGFP: llä (MOI 10 ). Mittakaava on 50 µm. c Vector genome copy number per diploidi genomi in c2c12 myotubes 72 h jälkeen lisätään AAV6-EGFP tai AAV6-GDF11PRO-Fc (MOI 10). d edustavat immunofluoresenssikuvat c2c12 myotubeista. C2c12 myotube kalvot visualisoitiin värjäämällä anti-dystrofiini vasta (punainen). Ytimet värjättiin dapilla (sininen). Pikkukuvassa näkyy zoomattu alue. Asteikkotangot edustavat 50 µm: aa (pääpaneeli) ja 25 µm: aa (paneelin pikkukuva). e myotuubeihin sisältyvien ytimien osuus (differentiaatioindeksi) laskettiin ja esitettiin prosentteina kontrollista. f keskimääräinen myotuben halkaisija suhteessa kontrolliin ja (g) halkaisijan mittausten jakauma. Myotuben halkaisijan mittauksissa jokainen myotube mitattiin kolmessa pisteessä myotuben pituudelta ja laskettiin keskiarvoksi. h sisältyvien ydinten määrä myotubea kohti. Yhtä kokeellista tilaa kohti analysoitiin vähintään 50 myotubea. I pSMAD2/3 suhteessa tSMAD2/3 arvioitiin western blot. Yhtä suuri proteiinikuormitus varmistettiin Ponceau s-värjäyksellä ja lastauskontrollina käytettiin gapdh: ta. Tiedot edustavat tuloksia kolmesta erillisestä kokeesta. Kaikki virhetangot edustavat keskiarvoa ± sem. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; n.s. not significant; compared to AAV6-EGFP-treated control. †p < 0.05; ††p < 0.01; †††p < 0.001; compared to AAV6-EGFP + ligand-treated. pSMAD2/3: phosphorylated SMAD2/3; tSMAD2/3: total SMAD2/3

Forty-eight hours after AAV treatment, rGDF11 or rMSTN was added to the media to a final concentration of 100 ng/ml. 72 tuntia myöhemmin myotubes kiinnitettiin ja värjättiin immunofluoresenssianalyysiin käyttäen vasta-ainetta, joka tunnistaa dystrofiinin (sauva 22/sauva 23) myotuben perifeeristen kalvojen visualisoimiseksi ja DAPI myonukleiin värjäämiseksi (Kuva. 2d). Differentiaatioindeksin, joka määritellään myotuubeihin sisältyvän myonuklein osuutena, pienenemistä havaittiin rGDF11: llä (− 15%, p = 0, 0008) tai rmstn: llä (− 14%, p = 0, 0013) käsitellyissä myotuubeissa verrattuna käsittelemättömään kontrolliin. Tämä vaikutus kuitenkin kumoutui GDF11PRO-Fc: tä ilmentävillä C2C12 myotubeilla, joita hoidettiin rGDF11: llä (− 1, 9%; p = 0.0047 verrattuna rgdf11-käsiteltyyn kontrolliin) tai rMSTN: ään (− 3, 0%; p = 0, 0040 verrattuna rmstn-käsiteltyyn kontrolliin; Kuva. 2 e). Lisäksi C2C12 myotubet, joita hoidettiin AAV6-GDF11PRO-Fc: llä, vastustivat rGDF11: n tai rMSTN: n aiheuttamaa myotube-atrofiaa. Rgdf11: llä (− 39%; 0, 0002) tai rmstn: llä (− 35%; p = 0, 0003) hoidetuilla myotuubeilla havaittiin merkittävä väheneminen kontrolliin verrattuna. Päinvastoin, myotubet, jotka ilmentävät GDF11PRO-Fc: tä, joita hoidettiin rgdf11: llä (− 1, 8%; p = 0, 0005 verrattuna rgdf11-kontrolliin) tai rMSTN: llä (− 5, 3%; p = 0.0075, verrattuna rMSTN-käsiteltyyn kontrolliin) olivat suurelta osin ennallaan (Kuva. 2f ja g). Erillisessä kokeessa GDF11PRO-Fc ei pystynyt estämään rActivin A: n aiheuttamaa myotube-atrofiaa, mikä on linjassa havainnon kanssa, että GDF11PRO-Fc ei sido activin A: ta (Lisätiedosto 1: kuva S3).

Rgdf11-tai rMSTN-hoitoon liittyi myös pienempi määrä kypsiä myotubeja, joilla oli suurempi määrä myonukleia, mikä viittaa myotuubin erilaistumisen estymiseen. Myotubeja, joissa oli yli 11, oli vain 5,2% (p = 0, 0215) ja 7,2% (p = 0.0328) myotubeista, jotka on analysoitu rgdf11: llä ja rmstn: llä käsitellyissä soluissa. Vertailussa myotubet, joissa oli yli 11 ydintä, muodostivat 26% kontrollissa analysoiduista myotubeista. MYOTUUBEISSA, jotka ilmaisivat GDF11PRO-Fc: tä ja joita hoidettiin rgdf11: llä tai rMSTN: llä, niiden myotuubien osuus, joissa oli yli 11 myonukleia, oli 22% (p = 0, 0104 verrattuna rgdf11: llä hoidettuun kontrolliin) ja 19% (p = 0, 0404 verrattuna rmstn: llä hoidettuun kontrolliin) (Kuva. 2h). Lopuksi, yhteisymmärryksessä sen kanssa, mitä olisi odotettavissa Gdf11/Mstn-signaloinnin jälkeen ActRII: ssä, fosforyloidun SMAD2/3 (pSMAD2/3) – proteiinipitoisuuksien nousu aav6-EGFP: llä ja rGDF11: llä tai rMSTN: llä käsitellyissä myotubeissa oli havaittavissa western blotissa 24 h ligandin lisäämisen jälkeen (kuva. 2). Tätä pSMAD2/3-tasojen nousua ei esiintynyt AAV6-GDF11PRO-Fc-valmisteella hoidetuissa myotuubeissa, mikä viittaa siihen, että GDF11PRO-Fc-lauseke estää GDF11/MSTN: n aiheuttamaa SMAD2/3: n aktivoitumista erilaistuneissa myotuubeissa. Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittavat, että GDF11PRO-Fc kykeni estämään rGDF11: n ja rMSTN: n aiheuttamaa myotube-atrofiaa ja erilaistumisen estoa C2C12-soluissa.

paikallinen Gdf11pro-Fc-ekspressio indusoi luustolihasten hypertrofiaa aikuisilla hiirillä

aiemmin olemme osoittaneet, että gdf11pro-Fc: n systeeminen vektorivälitteinen geenin toimitus vastasyntyneille hiirille johti luustolihasten kasvun merkittävään nopeutumiseen . Tämän tutkimuksen perusteella oli kuitenkin epäselvää, tehostiko GDF11PRO-Fc yksinkertaisesti luustolihasten kasvua vai aiheuttiko se todellisuudessa luustolihasten hypertrofiaa. Ei myöskään ollut mahdollista määrittää, välittyivätkö GDF11PRO-Fc: n vaikutukset gdf11/mstn: n paikalliseen salpaukseen luurankolihaksissa vai johtuivatko havaitut vaikutukset gdf11/MSTN: n systeemisestä modulaatiosta. Näiden kysymysten ratkaisemiseksi arvioimme lihakseen annetun AAV9-GDF11PRO-Fc-valmisteen vaikutusta aikuisilla c57bl/6J-hiirillä. Näissä tutkimuksissa pistettiin vain oikean puolen takaraajalihakseen ja vertailukohtana käytettiin vasemman puolen vastakkaista takaraajalihasta.

Aav9-GDF11PRO-Fc-hoitoa saaneiden hiirten paino nousi hieman ajan myötä (+ 10% 10 viikon kohdalla; p = 0, 0418; viikuna. 3 A). Lisäksi yksittäisen takaraajan painoon normalisoitu otteen lujuus lisääntyi merkittävästi molemmissa raajissa, jotka testattiin erikseen, ja vaikutus oli suurempi hoidetulla oikean puolen takaruumiilla (+37%; p = 0, 0177), joskin myös hoitamattomalla vasemmalla puolella olevalla takaruumiilla (+18%; p = 0, 0426) havaittiin normalisoidun otteen voimakkuuden merkittävää lisääntymistä. Tämä ero ei kuitenkaan saavuttanut merkitystä, kun molemmat takaraajat testattiin samanaikaisesti (+ 15%; p = 0, 2375; Fig. 3b). Kymmenen viikon kuluttua vektorin antamisesta oikean puolen takaruumis oli selvästi suurempi hiirillä, joita hoidettiin AAV9-GDF11PRO-Fc: llä (Kuva. 3c). Aav9-GDF11PRO-Fc-valmisteella hoidetuilla hiirillä pistetyn oikean puolen tibialis anteriorin (+ 50%; p = 0, 0046) ja gastrocnemiuksen (+ 37%; p = 0, 0023) märkä kudosmassa oli merkitsevästi suurempi kuin ajoneuvolla käsitellyillä verrokeilla. Hoitamattomien vasemman puolen takaruumiin lihasten märässä kudosmassassa ei ollut tilastollisesti merkitsevää eroa (kuva. 3d). Myofiberin pinta-alan analyysi paljasti keskimääräisen myofiberin poikkileikkausalueen kasvun (+ 15%; p = 0.0078)aav9-GDF11PRO-Fc-ruiskutetussa oikeanpuoleisessa gastrocnemiuksessa (Kuva. 3e ja f). MFD: n jakautumisanalyysi paljasti myös siirtymisen kohti suurempia myofibereita hiirten oikean puolen gastrocnemiuksessa, johon ruiskutettiin AAV9-GDF11PRO-Fc: tä (Kuva. 3g), mikä viittaa siihen, että paikallinen GDF11PRO-Fc-ilmentymä aiheutti lihasten liikakasvua. Erillisessä kohortissa arvioimme myös gdf11: n paikallisen geenitoimituksen vaikutusta antamalla lihakseen aav9-GDF11: tä oikean puolen takaruumiiseen, ja merkittävää lihasatrofiaa havaittiin 10 viikkoa hoidon jälkeen ruiskutetussa takaruumiissa (Lisätiedosto 1: kuva S4).

GDF11PRO-Fc aiheuttaa paikallista luustolihaksen hypertrofiaa lihaksensisäisen geenisynnytyksen jälkeen. 8 viikon ikäisiä c57bl/6J-hiiriä hoidettiin AAV9-GDF11PRO-Fc: llä (N = 5) tai vehicle-valmisteella (N = 5) antamalla yksipuolinen lihaksensisäinen injektio oikean puolen takaruumiiseen. Vastakkaista vasemman puolen takaruumista ei hoidettu. Hiiret lopetettiin 10 viikkoa hoidon jälkeen. keskimääräinen paino ajan myötä. b takaruumiin Pitovoima normalisoitui painoon 10 viikkoa hoidon jälkeen. Kuvassa mittauksia yhdestä takaruumiista ja molemmista takaruumiista. C edustava ällö takaraajan lihaksisto. Pistetty takaruumis merkitään mustalla nuolella. d tibialis anterior-ja gastrocnemius-Märkäkudosten paino. e edustavat immunofluoresenssikuvat ruiskutetuista gastrocnemius-poikkileikkauksista, jotka on värjätty Alexafluori-488-konjugoidulla WGA: lla myofiberien visualisoimiseksi. Asteikkotangot edustavat 100 µm. f keskimääräinen myofiberin poikkileikkauksen alue ruiskutetussa oikean puolen gastrocnemiuksessa. g Myofiber MFD Jakelu pistetään oikealla puolella gastrocnemius. Hiirtä kohti mitattiin vähintään 500 myofiberia. h Gdf11pro-Fc: n Western blot-tunnistus kudoslysaateista, jotka on saatu hoidettujen hiirten ruiskutetuista gastrocnemius-ja maksanäytteistä. Gdf11pro-Fc: tä ei ollut havaittavissa ajoneuvolla hoidetuilla hiirillä. Yhtä suuri proteiinikuormitus varmistettiin Ponceau s-värjäyksellä ja lastauskontrollina käytettiin gapdh: ta. Kaikki virhetangot edustavat keskiarvoa ± sem. * p < 0, 05; **p < 0, 01; n.s. ei merkittävä; verrattuna ajoneuvolla käsiteltyyn kontrolliin. TA tibialis anterior, Gas gastrocnemius

Western blot-analyysi osoitti, että Gdf11pro-Fc-proteiini ilmaistiin aav9-GDF11PRO-Fc-ruiskussa oikealla puolella gastrocnemius (58 kDa-kaista; Kuva. 3T). GDF11PRO-Fc: tä ei kuitenkaan voitu havaita hoitamattomassa vasemman puolen gastrocnemiuksessa samalla ladatulla kokonaisproteiinimäärällä, mikä viittaa siihen, että suurin osa gdf11pro-Fc: n luurankolihaksesta oli paikallistettu ruiskutettuun oikean puolen takaruumiiseen (tietoja ei näy). Gdf11pro-Fc oli havaittavissa myös maksassa western blot-menetelmällä, mikä viittaa jonkin verran systeemiseen altistumiseen (Kuva. 3T). Tämä havainto voi todennäköisimmin johtua aav9-vektorin verisuonivuodosta systeemiseen verenkiertoon injektiokohdasta . Näistä tiedoista päätämme, että gdf11pro-Fc aiheuttaa luustolihasten hypertrofiaa aikuisilla hiirillä. Lisäksi nämä vaikutukset välittyvät ainakin osittain paikallisen gdf11/MSTN-salpauksen välityksellä luurankolihaksissa, todennäköisesti estämällä ligandi-interaktioita actrii: n kanssa luurankolihaskudoksessa.

systeeminen GDF11PRO-Fc-geenitoimitus lisää luustolihasmassaa ja voimaa MDX-hiirillä

seuraavaksi arvioimme systeemisen GDF11PRO-Fc-ekspression vaikutusta MDX-hiirillä selvittääksemme, voisiko GDF11PRO-Fc aiheuttaa myös hypertrofiaa ja lisätä voimaa dystrofisessa luustolihaksessa. Tätä tutkimusta varten gdf11pro-Fc: n rakennetta muutettiin mutaatiolla, jotta se ei läpäise endogeenista bmp1/TLD: n kaltaista metalloproteinaasin pilkkoutumista (GDF11PRO-Fc D122A) ja lisää tekijän pysyvyyttä systeemisessä verenkierrossa . Näissä kokeissa arvioitiin sekä AAV9-GDF11PRO-Fc että AAV9-GDF11PRO-Fc D122A sen määrittämiseksi, johtaisiko mutatoitunut d122a-transgeeni voimakkaampaan vaikutukseen in vivo. Systeemisen ilmentymisen saavuttamiseksi MDX-hiiriä hoidettiin vektorilla tai vehicle-injektiolla pyrstölaskimoon. Laskimonsisäisen annostelun jälkeen AAV9-vektori siirtää hiiren maksan suurella hyötysuhteella. Transduced maksasolut voi sitten ilmaista transgeeni ja erittää proteiinituote systeemiseen verenkiertoon .

3 viikkoa injektion jälkeen havaitsimme merkittävää painon nousua, joka jatkui tutkimuksen ajan AAV9-GDF11PRO-Fc (+ 7, 7% 12 viikon kohdalla; p = 0, 0094) ja AAV9-GDF11PRO-Fc D122A (+ 11% 12 viikon kohdalla; P = 0, 006)-hoidoilla (Kuva. 4 A). On huomattava, että dystrofisen patologian vuoksi MDX-hiirillä esiintyy tyypillisesti kompensoivaa lihasten hypertrofiaa, joka voi osittain peittää gdf11pro-Fc-ilmentymän aiheuttaman lihasmassan lisääntymisen. Lihastoimintatesteissä hoidetuilla hiirillä todettiin lisääntynyt eturaajan Pitovoima, vaikka ne olivat normalisoituneet ruumiinpainoon. Ero normalisoidussa eturaajan pitovoimassa saavutti kuitenkin tilastollisen merkitsevyyden vasta aav9-GDF11PRO-Fc D122A-ryhmässä. 12 viikkoa hoidon jälkeen aav9-GDF11PRO-Fc: llä ja AAV9-GDF11PRO-Fc D122A: lla hoidetuilla hiirillä keskimääräinen normalisoitu eturaajan Pitovoima kasvoi + 28% (p = 0, 0873) ja + 36% (P = 0, 0248) (Kuva. 4b). Rotarodin suorituskykyä paransi myös keskimäärin aav9-GDF11PRO-Fc D122A-hoito (+ 93% rotarodin latenssiajan lisäys; p = 0, 0127). Rotarodin suorituskyky parani myös AAV9-GDF11PRO-Fc-ryhmässä, mutta tämä ero ei saavuttanut tilastollista merkitsevyyttä (+ 44% lisäys rotarodin latenssiaikaan; p = 0,2835; Fig. 4c). Juoksumattojen juoksuajassa ei havaittu eroa minkään ryhmän välillä (Kuva. 4d).

GDF11PRO-Fc parantaa pitovoimaa ja rotarodien suorituskykyä dystrofisilla MDX-hiirillä. 6 viikon ikäisiä MDX-hiiriä hoidettiin aav9-GDF11PRO-Fc: llä (n = 7), AAV9-GDF11PRO-Fc D122A: lla (n = 7) tai vehikkelillä (n = 7) häntälaskimoon annetulla injektiolla. keskimääräinen paino ajan myötä. b Eturaajan otteen vahvuus normalisoitui ruumiinpainoon ajan myötä. c paras rotarodin kaatumisaika mitattuna ennen hoitoa (lähtötilanne) ja 12 viikkoa hoidon jälkeen. Paras aika kolmesta yrityksestä käytettiin analyysiin. d juoksumatkojen kokonaiskesto juoksumatolla ennen hoitoa (lähtötilanne) ja 12 viikkoa hoidon jälkeen. Kaikki virhetangot edustavat keskiarvoa ± sem. *p < 0, 05; * * p < 0, 01; ei merkitsevä; verrattuna vehicle-treated-kontrolliin

12-viikon tutkimus, lihasten liikakasvu oli räikeästi havaittavissa hoidetuilla hiirillä (kuva. 5 a). Tibialis anterior -, gastrocnemius-ja quadriceps-alueen keskimääräiset märkäkudosmassat kasvoivat + 17% (p = 0, 0472), + 20% (p = 0, 0011) ja + 14% (p = 0.0333), vastaavasti aav9-GDF11PRO-Fc-ryhmässä. AAV9-GDF11PRO-Fc d122a-ryhmässä nämä arvot nousivat vielä + 26%: iin (p = 0, 0030), + 31%: iin (p = 0, 0003) ja + 23%: iin (p = 0, 0009) verrattuna ajoneuvolla käsiteltyyn vertailuryhmään sääriluiden anteriorisen massan, gastrocnemius-massan ja quadriceps-massan keskimääräisen muutoksen osalta. Lisäksi pallean märkäkudoksen massa kasvoi + 19% (p = 0, 0162) ja + 26% (p = 0, 0014) aav9-GDF11PRO-Fc-ja AAV9-GDF11PRO-Fc D122A-ryhmissä. Mielenkiintoista on, että sydämen massa ei merkittävästi muuttunut hoidon ansiosta. Gastrocnemius myofiberin poikkileikkauksen keskimääräinen pinta-ala oli suurempi hiirillä, joita hoidettiin AAV9-GDF11PRO-Fc: llä (+ 23%; p = 0, 0226) ja AAV9-GDF11PRO-Fc D122A: lla (+ 25%; p = 0, 0170; Fig. 5c ja d). MFD: n jakaantumisanalyysissä MFD: n huippu oli yleensä noin 20-30 µm kaikissa ryhmissä, mikä johtuu todennäköisesti pienten regeneroituvien myofiberien suuremmasta osuudesta dystrofisessa lihaksessa. Aav9-GDF11PRO-Fc-ja AAV9-GDF11PRO-Fc D122A-hoito kuitenkin lisäsi myofiberien osuutta, kun Monikäyttölaitteet olivat yli 64 µm, mikä viittaa siihen, että tekijän ilmentyminen oli aiheuttanut myofiberin hypertrofiaa (Kuva. 5e) luurankolihaksissa.

GDF11PRO-Fc aiheuttaa dystrofisilla MDX-hiirillä luustolihasten hypertrofiaa. 6 viikon ikäisiä MDX-hiiriä hoidettiin aav9-GDF11PRO-Fc: llä (n = 7), AAV9-GDF11PRO-Fc D122A: lla (n = 7) tai vehikkelillä (n = 7) häntälaskimoon annetulla injektiolla. Hiiret lopetettiin 12 viikkoa hoidon jälkeen. edustava ällö takaraajalihas. B raajan lihasten, pallean ja sydämen Märkäkudoksen paino. C edustavat immunofluoresenssikuvat gastrocnemius-poikkileikkauksista, jotka on värjätty Alexafluorilla-488-konjugoidulla WGA: lla myofiberien visualisoimiseksi. Asteikkotangot edustavat 100 µm. d keskimääräinen myofiber poikkileikkauksen alueen gastrocnemius. e Myofiber MFD Jakelu gastrocnemius. Hiirtä kohti mitattiin vähintään 500 myofiberia. f GDF11PRO-Fc: n tunnistaminen western blot-menetelmällä AAV9-GDF11PRO-Fc: llä hoidettujen hiirten maksakudoslysaatista ja seerumista. Yhtä suuri proteiinikuormitus varmistettiin Ponceau s-värjäyksellä ja gapdh: ta käytettiin lastauskontrollina maksakudoksen lysaateissa. *p < 0, 05; **p < 0, 01; **p < 0, 001; n.s. ei merkittävä; verrattuna ajoneuvolla käsiteltyyn kontrolliin

Western blot-analyysi vahvisti transgeenien proteiiniekspression maksassa ja seerumissa. Hoidetuilla hiirillä havaittiin odotetusti 58 kDa: n taajuusalue, joka vastasi täyspitkää GDF11PRO-Fc: tä tai GDF11PRO-Fc D122A: ta. Täyspitkän propeptidin seerumitasot olivat hieman korkeammat aav9-GDF11PRO-Fc D122A: lla hoidetuilla hiirillä kuin AAV9-GDF11PRO-Fc: llä hoidetuilla hiirillä, mikä viittaa siihen, että d122a-mutaatio lisäsi aktiivisen propeptidin pysyvyyttä seerumissa (Kuva. 5 F).

kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittavat, että gdf11pro-Fc: n systeeminen ilmentyminen ja GDF11PRO-Fc d122a lisää dystrofisten MDX-hiirten luustolihasmassaa ja että tämä luustolihasten hypertrofia liittyy pitolujuuden ja motorisen koordinaation paranemiseen. Hoito ei kuitenkaan näyttänyt vaikuttavan lihaskestävyyteen juoksumatolla suoritetun juoksun perusteella. Lisäksi d122a-mutantti näytti olevan hieman tehokkaampi lihasmassan ja toiminnan kasvattamisessa, oletettavasti parantuneen seerumin pysyvyyden ansiosta.

systeeminen GDF11PRO-Fc-geenitoimitus ei vähennä dystrofista patologiaa MDX-hiirillä

useat tutkimukset ovat ilmoittaneet, että TGF-β-ActRII-SMAD2 / 3-signaloinnin salpauksella, joko Mstn: n estolla tai actrii: n salpauksella, voi olla terapeuttista hyötyä DMD: n eläinmalleissa . Selvittääksemme aav9-GDF11PRO-Fc-hoidon vaikutusta dystrofiseen patologiaan suoritimme raajalihasten ja pallean histologisen analyysin.

dystrofisen patologian tyypilliset merkit, kuten lihasnekroosi, keskushermoston nukleaatio, kollageenin intramuskulaatio ja tulehdusinfiltraattien esiintyminen, olivat havaittavissa kaikissa mdx-ryhmissä (Kuva. 6 A). Gastrocnemius − tutkimuksessa aav9-GDF11PRO-Fc-hoitoa saaneilla hiirillä fibroottisen alueen prosenttiosuus pieneni-39% (p = 0, 0273). Gastrocniuksen fibroosi väheni hieman myös aav9-GDF11PRO-Fc D122A-ryhmässä; koska raajalihaksen lihakseen kohdistuvassa fibroosissa esiintyy suurta yksilöiden välistä vaihtelua, tämä ero ei kuitenkaan saavuttanut tilastollista merkitsevyyttä (− 28%; p = 0, 1230; Fig. 6b). Myöskään keskitetysti nukleoituneiden myofiberien osuudessa ei havaittu merkittävää eroa, mikä viittaa siihen, että myofiberin uusiutumista tapahtui aktiivisesti kaikissa ryhmissä (Fig. 6c). Seerumin CK, joka on lihasten hajoamisen merkkiaine, ei myöskään muuttunut merkittävästi hoidon vaikutuksesta(Kuva. 6d). Lisäksi myofiber-kalvon eheyden paikallinen heikkeneminen, mitattuna hiiren IgG-immunofluoresenssivärjäyksellä, oli ilmeistä kaikissa mdx-ryhmissä. Yllättäen mdx-hiirillä, joita hoidettiin AAV9-GDF11PRO-Fc D122a-valmisteella, IgG-positiivisella alueella havaittiin keskimäärin lievää kasvua, mutta tämä ero ei saavuttanut tilastollista merkitsevyyttä (+ 55%; p = 0, 1729; Fig. 6e ja f; Lisätiedosto 1: kuva S5). Selviä merkkejä myofiber-nekroosista, regeneraatiosta, keskushermoston nukleaatiosta ja IgG-penetraatiosta ei havaittu luonnonvaraisessa tyypissä C57BL/10J gastrocnemius, mikä osoittaa, että nämä markkerit ovat erityisiä dystrofiselle patologialle (Kuva. 6a-f; Lisätiedosto 1: kuva S5).

GDF11PRO-Fc ei lievennä dystrofista patologiaa MDX-hiirillä. 6 viikon ikäisiä MDX-hiiriä hoidettiin aav9-GDF11PRO-Fc: llä (n = 7), AAV9-GDF11PRO-Fc D122A: lla (n = 7) tai vehikkelillä (n = 7) häntälaskimoon annetulla injektiolla. Villin tyypin vertailukohteeksi otettiin myös Age-matched c57bl/10J (N = 5) – hiiret. Hiiret lopetettiin 12 viikkoa hoidon jälkeen. edustaja hän ja MTC värjäystä gastrocnemius poikkileikkaukset c57bl / 10J ja MDX hiiriä. Keskeinen nukleaatio on havaittavissa kaikissa mdx-ryhmissä. Myofiberin nekroosin ja uusiutumisen paikalliset alueet on merkitty mustalla nuolella. Fibroottista aluetta edustaa MTC-värjäyksessä sininen alue. Vaa ’ at edustavat HE-jaksoissa 50 µm ja MTC-jaksoissa 100 µm. B gastrocnemiuksen fibroottinen alue ilmaistuna prosentteina lihaksen poikkileikkauksen kokonaispinta-alasta. C prosentuaalinen osuus myofibereistä, joilla on keskeinen nukleaatio. d verenkierrossa olevan seerumin CK-pitoisuuden mittaaminen, lihasvaurioiden merkkiaine. e edustavat immunofluoresenssikuvat hiiren IgG-värjäyksestä (punainen) gastrocnemius-kudoksen poikkileikkauksissa. Positiivinen värjäys IgG: lle osoittaa myofiberin läpäisevyyden seerumin proteiineille ja kalvon eheyden menetyksen. Osiot värjättiin yhdessä WGA: n kanssa yksittäisten myofiberien visualisoimiseksi. Zoomattu alue on merkitty valkoisella laatikolla. Tunnusomaiset IgG-positiiviset myofiberit on kuvattu valkoisella nuolella. Asteikkotangot edustavat 100 µm. f IgG-positiivisten myofiberien pinta-ala ilmaistuna prosentteina lihaksen poikkileikkauksen kokonaispinta-alasta. g edustaa HE-ja MTC-värjäystä c57bl/10J-ja MDX-hiirten kalvoristikoista. Laaja patologia ilmenee mdx: ssä, mutta ei c57bl/10J-hiirissä. Asteikkotangot edustavat 100 µm. h fibroottinen alue palleassa ilmaistuna prosentteina poikkileikkauksen kokonaispinta-alasta. * p < 0, 05; ***p < 0, 001; ***p < 0, 0001; ei merkittävä; verrattuna vehikkelillä hoidettuihin MDX-kontrolleihin

kalvossa, h&e värjäytyminen paljasti laajan nekroosin ja lihaksensisäisen kollageenikertymän sekä käsitellyissä että käsittelemättömissä MDX-ryhmissä (Kuva. 6g). Samoin kuin gastrocnemius-lihaksessa, aav9-GDF11PRO-Fc-tai AAV9-GDF11PRO-Fc D122A-hoito vähensi lievästi pallean lihaksensisäistä fibroosia. Keskimääräinen fibroottisen alueen prosenttiosuus palleassa pieneni 15% (p = 0, 0328) ja 17% (p = 0.019) aav9-GDF11PRO-Fc: llä ja AAV9-GDF11PRO-Fc D122A-hoidolla (Kuva. 6 tuntia). Odotetusti nämä patologiset ominaisuudet puuttuivat suurelta osin luonnonvaraisten c57bl/10J-hiirten palleasta (Kuva. 6g ja h). Näistä tiedoista päätämme, että GDF11PRO-Fc ja GDF11PRO-Fc D122A pystyvät lievästi estämään lihaksensisäistä kollageenikertymää raajan lihaksissa ja palleassa 3 kuukauden aikana. Hoito ei kuitenkaan näytä pysäyttävän käynnissä olevaa lihasrappeumakiertoa ja uusiutumista aikuisten MDX-hiirten gastrocnemiuksessa tai palleassa.