Provádění HPLC

Úvod

Vysoce účinná kapalinová chromatografie je v podstatě vysoce vylepšené podobě pro sloupcovou chromatografii. Místo toho, aby rozpouštědlo mohlo kapat kolonou pod gravitací, je protlačováno pod vysokými tlaky až 400 atmosfér. To je mnohem rychlejší.

To také umožňuje použít mnohem menší velikost částic pro sloupec obalového materiálu, který poskytuje mnohem větší povrch pro interakce mezi stacionární fázi a molekuly proudí přes to. To umožňuje mnohem lepší oddělení složek směsi.

další významné zlepšení oproti sloupcové chromatografii se týká detekčních metod, které lze použít. Tyto metody jsou vysoce automatizované a extrémně citlivé.

kolona a rozpouštědlo

matoucí je, že v HPLC se používají dvě varianty v závislosti na relativní polaritě rozpouštědla a stacionární fázi.

normální fáze HPLC

je to v podstatě stejné, jaké jste již četli v tenkovrstvé chromatografii nebo sloupcové chromatografii. Ačkoli je popisován jako „normální“, není to nejčastěji používaná forma HPLC.

kolona je naplněna malými částicemi oxidu křemičitého a rozpouštědlem je například nepolární hexan. Typické sloupec má vnitřní průměr 4,6 mm (a může být menší než) a délce 150 až 250 mm.

Polárních sloučenin ve směsi se prošel sloupec bude držet déle polární oxid křemičitý, než non-polární sloučeniny. Nepolární proto budou kolonou procházet rychleji.

reverzní fázi HPLC

V tomto případ, sloupec velikost je stejná, ale oxid křemičitý je upravena tak, aby to non-polar připojením dlouhé uhlovodíkové řetězce k jeho povrchu – typicky buď s 8 nebo 18 uhlíkových atomů v nich. Používá se polární rozpouštědlo – například směs vody a alkoholu, jako je methanol.

v tomto případě bude silná přitažlivost mezi polárním rozpouštědlem a polárními molekulami ve směsi procházející kolonou. Mezi uhlovodíkovými řetězci připojenými k oxidu křemičitému (stacionární fáze) a polárními molekulami v roztoku nebude tolik přitažlivosti. Polární molekuly ve směsi proto tráví většinu času pohybem s rozpouštědlem.

Non-polární sloučeniny ve směsi se mají tendenci tvořit atrakce s uhlovodíkové skupiny, protože van der Waalsových disperzních sil. Budou také méně rozpustné v rozpouštědle kvůli potřebě rozbít vodíkové vazby, když se například stlačují mezi molekuly vody nebo methanolu. Proto tráví méně času v roztoku v rozpouštědle, což je zpomalí na cestě kolonou.

to znamená, že nyní jsou to polární molekuly, které budou procházet kolonou rychleji.

obrácená fáze HPLC je nejčastěji používanou formou HPLC.