Jediný paprsek skenovací spektrofotometr

Existují dvě hlavní kategorie zařízení: jedno světlo a dvojitý paprsek. O dvoupaprskový spektrofotometr porovnává intenzitu světla mezi dvěma lehké cesty, jedna cesta obsahující referenční vzorek a druhé zkušební vzorek. Jednosvazkový spektrofotometr měří relativní intenzitu světla paprsku před a po vložení zkušebního vzorku. I když srovnání měření z double-beam nástroje jsou jednodušší a více stabilní, single-beam nástroje mohou mít větší dynamický rozsah a jsou opticky jednodušší a více kompaktní. Některé specializované přístroje, jako jsou spektrofotometry zabudované na mikroskopy nebo dalekohledy, jsou navíc díky praktičnosti jednosvazkovými nástroji.

historicky spektrofotometry používají monochromátor obsahující difrakční mřížku k výrobě analytického spektra. Mřížka může být pohyblivá nebo pevná. Pokud jeden detektor, jako je například trubice fotonásobiče nebo fotodiody je použit rošt může být snímána postupně (skenovací spektrofotometr) tak, že detektor může měřit intenzitu světla na jednotlivé vlnové délky (což bude odpovídat na každý „krok“). Pole detektorů (array spektrofotometr), jako poplatek spojený zařízení (CCD), nebo fotodioda pole (PDA), může být také použit. V takových systémech je mřížka fixována a intenzita každé vlnové délky světla je měřena jiným detektorem v poli. Většina moderních mid-infračervených spektrofotometrů navíc používá techniku Fourierovy transformace k získání spektrálních informací. Tato technika se nazývá Fourierova transformační infračervená spektroskopie.

Při přenosu měření spektrofotometr kvantitativně porovnává frakce světla, které prochází referenční řešení a testovací řešení, pak elektronicky srovnání intenzit dvou signálů a vypočítá procento přenosu vzorku oproti referenčnímu standardu. Pro měření odrazivosti spektrofotometr kvantitativně porovnává zlomek světla, který se odráží od referenčních a zkušebních vzorků. Světlo ze zdroje lampy je předán prostřednictvím monochromator, které ohýbá světlo do „duha“ vlnových délek přes rotující hranol a výstupy úzkou šířkou pásma z tohoto difraktovaného spektra pomocí mechanické štěrbinou na výstupní straně monochromator. Tyto šířky pásma jsou přenášeny zkušebním vzorkem. Pak photon flux density (wattů na metr na druhou obvykle) vysílané nebo odražené světlo je měřeno fotodiodou, poplatek spojený zařízení nebo jiné světelné čidlo. Hodnota propustnosti nebo odrazivosti pro každou vlnovou délku zkušebního vzorku se pak porovná s hodnotami přenosu nebo odrazivosti z referenčního vzorku. Většina přístrojů použije logaritmickou funkci na lineární propustnost pro výpočet „savosti“ vzorku, což je hodnota, která je úměrná „koncentraci“ měřené chemické látky.

stručně řečeno, sled událostí ve skenovací spektrofotometr je následující:

1. je zdroj světla zářila do monochromator, difraktovaného do duhy, a rozdělí se na dva paprsky. Poté se naskenuje vzorkem a referenčními řešeními.
2. frakce dopadajících vlnových délek jsou přenášeny nebo odrazeny od vzorku a reference.
3. výsledné světlo dopadá na fotodetektorové zařízení, které porovnává relativní intenzitu obou paprsků.
4. elektronické obvody převádějí relativní proudy na lineární přenosová procenta a / nebo hodnoty absorbance/koncentrace.

v spektrofotometru pole je sekvence následující:

1. je zdroj světla zářila do vzorku a zaměřil do štěrbiny
2. přenáší světlo láme do duhy s odrazem rošt
3. výsledné světlo dopadá na fotodetektor zařízení, které porovnává intenzita paprsku,
4. Elektronické obvody převést relativní proudu do lineární přenos procenta a/nebo absorbance/koncentrace, hodnoty

Mnoho starších spektrofotometry, musí být kalibrován pomocí postupu známého jako „nulování“, vyvážit nulový aktuální výstupní dva paprsky na detektor. Přenos referenční látka je nastavit jako výchozí (nulové) hodnoty, takže přenos všech ostatních látek jsou zaznamenány v poměru k počáteční „vynuluje“ látky. Spektrofotometr pak převede převodový poměr na „savost“, což je koncentrace specifických složek zkušebního vzorku vzhledem k počáteční látce.

aplikace v biochemii

spektrofotometrie je důležitá technika používaná v mnoha biochemických experimentech, které zahrnují izolaci DNA, RNA a proteinů, kinetiku enzymů a biochemické analýzy. Protože vzorky v těchto aplikacích nejsou snadno dostupné ve velkém množství, jsou zvláště vhodné pro analýzu touto nedestruktivní technikou. Kromě toho, vzácný vzorek lze uložit pomocí platformy s mikroobjemem, kde je pro úplné analýzy vyžadováno jen 1 ul vzorku. Stručné vysvětlení postupu spektrofotometrie zahrnuje porovnání savosti prázdného vzorku, který neobsahuje barevnou sloučeninu, se vzorkem, který obsahuje barevnou sloučeninu. Toto zbarvení může být provedeno tím, že buď barvivo jako Coomasie Brilliant Blue G-250 barvivo měřená při 595 nm nebo enzymatické reakce, jak je vidět mezi β-galaktosidázy a ONPG (otočí vzorku žlutá) měřena při 420 nm.:21-119 spektrofotometru se používá k měření barevné sloučeniny ve viditelné oblasti světla (mezi 350 nm a 800 nm): 65 tak to může být použit k najít více informací o zkoumané látky. V biochemických experimentech je zvolena chemická a / nebo fyzikální vlastnost a použitý postup je specifický pro tuto vlastnost, aby bylo možné odvodit více informací o vzorku, jako je množství, čistota, enzymová aktivita atd. Spektrofotometrie může být použit pro řadu technik, jako je stanovení optimální vlnové délky absorbance vzorků, stanovení optimálního pH pro absorbanci vzorků, stanovení koncentrace neznámých vzorků a stanovení pKa různých vzorků.:Spektrofotometrie 21-119 je také užitečným procesem pro čištění proteinů a může být také použita jako metoda pro vytvoření optických testů sloučeniny. Spektrofotometrické údaje mohou být také použity ve spojení s Beer-Lambert Rovnice, A = − log 10 ⁡ T = ϵ c l = O D {\textstyle S=-\log _{10}T=\epsilon cl=EK}

, aby bylo možné určit různé vztahy mezi transmitance a koncentrace, absorbance a koncentrace.:21-119 Protože spektrofotometr měří vlnová délka složeného prostřednictvím jeho barvu, vázání barviva látky mohou být přidány, tak, že může podstoupit změnu barvy a měří. Je možné znát koncentrace dvousložkové směsi pomocí absorpčních spekter standardních roztoků každé složky. K tomu je třeba znát koeficient extinkce této směsi ve dvou vlnových délkách a koeficienty extinkce roztoků, které obsahují známé hmotnosti obou složek. Spektrofotometry byly vyvinuty a vylepšeny po celá desetiletí a byly široce používány mezi chemiky. Spektrofotometry se navíc specializují na měření hodnot absorbance vlnové délky UV nebo viditelného světla.: 21-119 je považován za vysoce přesný nástroj, který je také velmi citlivý, a proto velmi přesný, zejména při určování změny barvy. Tato metoda je také vhodná pro použití v laboratorních experimentech, protože se jedná o levný a relativně jednoduchý proces.