Rostlinného materiálu

Pozorování a chemických analýz, které byly provedeny od roku 2011 do roku 2018 na sběr rostlin pěstovaných v experimentální zahradě na Univerzitě Louvain-la-Neuve campus (50°39’55″N, 4°37’11″E). Před a během období kvetení (červenec–srpen) byly rostliny umístěny do růstových komor univerzity za kontrolovaných podmínek (24/22 °C; 16 L: 8D, RH 80 ± 10%).

Hmyz materiál

hlavní hmyzí návštěvník druhů A. napellus (A. mellifera, B. pascuorum, B. terrestris), byly použity ve studiích květina atraktivity a chuťové preference. A. mellifera a a B. pascuorum jedinců (10 za test a léčby) byly sbírány v přírodě kolem univerzitního kampusu (minimálně čtyři místa za druhy) ráno před testy. Jako B. terrestris osob nelze snadno odlišit v oblasti (podobné morfologie pro několik druhů), použili jsme čmeláci ze čtyř úlů (Biobest, Westerloo, Belgie), umístěné v blízkosti univerzitních budov k získání jednotlivců pro experimentování.

Květinové vlastnosti

Pylu

prašníky 10 květy na samčí a samičí fáze byly shromážděny, počítá, sušené a umístěn na síto (90 µm), aby se vtírá sbírat pyl zrna. Bylo zváženo množství pylových zrn. Počty pylu byly provedeny na univerzitě Lille-1 (jednotka Evo-Eco-Paleo). Použili jsme počítadlo částic k odhadu počtu pylových zrn v těchto vzorcích. Den před počtem pylu byly vzorky umístěny do trubkového ohřívače, dokud se většina ethanolu neodpařila. Poté jsme vynutili dehiscenci prašníků umístěním vzorků do pece při teplotě 56 °C přes noc. Do každého vzorku pylu jsme přidali 1 mL destilované vody. Trubky byly poté sonikovány a vířeny, aby se oddělily pylová zrna od prašníků a navzájem. Pylový roztok (200 µL)byl poté zředěn v 5 mL izotonického měřicího pufru (CASY® ton). Počítadlo částic analyzovalo tři 400 µL vzorky z pylové suspenze, poskytlo celkový počet částic v tomto objemu 1200 µL a také počty pro 400 velikostních tříd v rozmezí od 0,125 do 150 µm. Srovnání s prázdnými vzorky nám umožnilo identifikovat vrcholy částic o velikosti od 20 do 30 µm, což odpovídá pylovým zrnům. Počet pylových zrn na prašník byl odhadnut vynásobením hodnot poskytnutých počítadlem částic ředicím poměrem (tj. (1000/200) × (5000 + 200)/1200).

Květina barva a morfologie

Jsme měřili květinové rysy (corolla délka, corolla průměr, květinové barvy a UV odrazivost) na 10 květů na fáze (od 10 různých jedinců). Šířka přilby, délka koruny a průměr byly měřeny pomocí třmenu. Měřili jsme tepal barva reflektanční spektra pomocí optického spektrometru (Avaspec-ULS2048) a xenon-pulzní světelný zdroj (AvaLight-XE, Avantes, Apeldoorn, Nizozemsko). Pro měření odrazivosti UV byly květiny fixovány na černém pozadí a fotografovány pomocí Nikon D40 (pobřežní optický 60 mm 1:4 UV-VIS-IR ApoMacro; filtr X-Nite 330).

Floral volatile collection

vzorkovali jsme těkavé organické sloučeniny (VOC) z intaktních květů samčí a samičí fáze (N = 4 pro každou fázi). Každá květina byla jednotlivě vložena do skleněné baňky (délka 50 mm a průměr 30 mm) s otvorem o průměru 17 mm. Aby se zabránilo znečištění vzduchu, jeden Teflon trubice naplněná aktivním uhlím, který byl připojen na jeden konec skleněné baňky a dvě skleněné Tenax TA trubek (6 mm × 4 mm, 7 palců; 60-80 mesh, Gerstel, Sigma-Aldrich, Overijse, Belgie) byl připojen na druhý konec. Ten Tenax tubes byly připojeny k kalibrované čerpadla (Gilair plus, Sensidyn, St. Petersburg, USA) při průtoku 50 mL·min−1 180 min (mezi 11:00 a 14:00 h). Laboratorní podmínky se pohybovaly mezi 21,5 a 23,5 °C s 45 až 55% RH.

v Pasti Voc byly následně tepelně desorbuje na Agilent 6800 plynový chromatograf vybaven Gerstel TDU thermodesorption jednotky a CIS cryocooler udržována na -50 °C. Ihned po thermodesorption, SNS jednotka T° byl naprogramován od -50 °C do 300 °C na 12 °C sec−1. Přístroj GLC byl spojen s hmotnostním spektrometrem Agilent 7975 C. Analytické podmínky byly následující: split režim vstřikování (split poměr 50:1, helium na 1,6 mL min−1 nosný plyn), VF-Max MS 30 m x 250 µm (df = 0.25 µm) kolona (Agilent). Teplotní program umožňuje nejlepší separační (předběžné testy neprokázaly) byla stanovena takto: 40 °C (5 min), pak na 75 °C na 4 °C min−1 a 115 °C (3 °C min−1) a konečně na 250 °C na 13 °C min−1. Podmínky MS byly následující: Režim EI při 70 eV, zdroj T ° = 250 °C, MS kvadrupole při 200 °C a rozsah skenované hmotnosti 35 až 500 amu.

zaznamenané chromatogramy byly systematicky interpretovány k hledání VOC specifických pro mužské nebo ženské fáze. Při detekci byly molekuly identifikovány podle vypočtených databází (Wiley 250.L a PAL 600). Identifikace byla potvrzena na základě retenčních údajů o komerčně dostupných čistých molekulách. Byly také kvantifikovány vzhledem k vysoce čistému vnitřnímu standardu (limonen, 1 µL roztoku methanolu při 0.67 µg µL1 se automaticky přidá do každé desorpční zkumavky před tepelným procesem).

okolní vzduch byl také shromažďován jako kontrola pro identifikaci kontaminantů pozadí. Aby se zabránilo možnému průlomu, byla druhá skleněná kazeta naplněná stejným adsorbentem (Tenax TA) systematicky umístěna v tandemu. Analýza neodhalila žádné stopy zajímavých molekul.

sběr a analýzy alkaloidů

prašníky byly odebrány z 50 květů (od 10 jedinců), vysušeny a poté rozdrceny na sítu (90 µm), aby se shromáždila pylová zrna. Tři repliky 15 mg pylu byly odebrány na alkaloidy. Vzorky byly zmrazeny (-80 °C) po dobu 2 h a poté lyofilizovány. Suché vzorky byly rozemlety na jemný prášek s kapalným dusíkem a zvážené množství prášku bylo umístěno do 1,5 mL mikrocentrifugační zkumavky (Eppendorf, Hamburk, Německo). Alkaloidy byly extrahovány za použití tkáňového homogenizátoru (VWR ultrazvukový čistič) po dobu 10 minut ve 100 µL extrakčního pufru (70% vodný methanol a 0,5% kyselina mravenčí). Po centrifugaci při 12 000 ot / min po dobu 5 minut (odstředivka 5430 R) se supernatant přenese do 1,5 mL mikrocentrifugační zkumavky. Po vysušení v SpeedVac byly alkaloidy resuspendovány ve 200 µL methanolu třídy LC-MS a filtrovány 0,45 µm PTFE stříkačkovým filtrem (Whatman).

Nektar bylo odebráno 5 µL skleněná kapilární trubice (Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt, Německo) z 50 květů (od 10 osob). Tři replikáty 15 µL nektaru byly vysušeny v SpeedVac a resuspendovány v 200 µL LC-MS-grade metanol před filtrací s 0,45-µm PTFE injekční filtr (Whatman).

Chemické analýzy byly provedeny pomocí LC-MS/MS systém, který se skládá z Termo Accela čerpadlo, autosampler, fotodioda pole detektoru a Thermo Scientific LTQ orbitrap XL hmotnostní detektor (MASSMET, Louvain Drug Research Institute, Woluwe, Belgie). Byla použita kolona Phenomenex Gemini C18 (2 mm × 150 mm, plná částic 3 µm). Binární rozpouštědlo systém s rychlostí průtoku 300 µL min−1 byl použit: rozpouštědlo, HPLC-grade voda (0,1% kyselina mravenčí); a rozpouštědlo B, LC-MS grade metanol (0 min: 95%, 10-12 min: 0%, 13-17 min: 95%). Byl injikován objem 10 µL a teplota kolony byla nastavena na 30 °C. MS s vysokým rozlišením bylo provedeno s elektrosprejovým ionizačním zdrojem v pozitivním režimu. Následující vstupní podmínky byly použity: kapilární teplota 275 °C; kapilární napětí 13 V, tube lens, 140 V; pouzdro průtoku plynu, 30.u.; a pomocné průtoku plynu, 10 u.a. Získávání dat a jejich zpracování bylo provedeno pomocí software Xcalibur. Tato metoda pokrývala hmotnostní rozsah všech alkaloidů (MW od 329 do 673). Alkaloidy z pylu a nektaru byly detekovány a předběžně identifikovány MS. s vysokým rozlišením Fragmentace získaná kolizní disociací pomohla při identifikaci. Alkaloid koncentrace byly vypočteny na základě akonitin standardní křivky v MeOH a vyjádřená jako „akonitin-ekvivalent“. Analyzované alkaloidy byly vybrány na základě jejich přítomnosti v jiných druzích Aconitum4, 8.

Nektar výroby a cukru složení

Nektar bylo odebráno 5 µL skleněná kapilární trubice (Hirschmann Laborgerate, Eberstadt, Německo) z květů rostlin převedeny na růstové komory v Univerzitním kampusu (žádný hmyz návštěv). Odhadli jsme trend produkce nektaru během dne na začátku antézy vzorkováním 2 květů od 12 jedinců každé 2 hodiny během 10 hodin. Také jsme měřili celkovou produkci nektaru na květ (2 květiny od 12 jedinců) pro stejné květiny každé 2 dny během celé (9 dní) délky života květů, ve stejnou dobu každý den, 2 hodiny po zapnutí světla. Celková produkce pro mužskou a ženskou fázi byla odhadnuta na základě odběru vzorků na konci mužské (5 dní po antéze) a ženské (8 dní) fáze.

vzorky nektaru byly skladovány při -80 °C, dokud nebyly provedeny chemické analýzy. Po odvození byla identifikace a kvantifikace cukru provedena pomocí GC-MS (Thermo Trace 1310 /Thermo ISQ-QD). Byla použita kolona Restek Rxi-5Sil MS (30 m x 0,25 mm ID, 0,25 µm df). Průtok byl 1,0 mL min-1 (helium). Vstřikované rozdělené poměry byly 1/10 pro hexózy a 1/100 pro sacharózu. Byly použity následující vstupní podmínky: teplota pece 105 °C po dobu 4 minut, poté 280 °C při 15 °C min-1 (po dobu 20 minut) a teplota vstřikovače 250 °C.Celkový obsah cukru v nektaru na květ (mg) byl poté vypočítán jako objem nektaru (µL) x celková koncentrace cukru (mg/µL).

chování hmyzu

v letech 2011 a 2012 proběhlo šetření u čtyř zbývajících přirozených populací ve slatinách v Jižní Belgii. Z těchto, přírodní rezervace „Les Abattis“ (49°40’50″N, 5°32’59″E) obsahuje největší a nejhustší populace (2970 m2, 1330 ± 1030 A. napellus květiny m−2). Na „Fouches“ (49°4 ‚ 8 „s. š.; 5°43′ 06 “ E), který má druhou největší populaci (1788 m2), jedinci a. napellus byly velmi rozptýlené po okolí a na mnohem nižší hustoty (176 ± 177 květiny m−2) „Chantemelle‘ (49°39’37″N, 5°39’37″E)‘ měl diskontinuální populace skládající se ze tří záplaty (161, 423, 500 m2) s relativně nízkou rostlin a květin hustoty (179 ± 125 květiny m−2). „Sainte-Marie“ (49°40’06″N, 5°32’56″E) měl malý a nerovnoměrný populace (292 m2, 152 ± 163 květiny m−2), rozkládající se asi 150 m po bývalé železniční trati.

Květina návštěvníků byl zaznamenán v 10-min připomínky při vrcholu kvetení na tři po sobě jdoucí dny v roce 2011 (mezi 30. srpna a 3. září) a na čtyři dny v roce 2012 (mezi 21. srpna a 27) s suché a teplé počasí. Podíl květů samčí fáze byl v těchto dnech a ve všech populacích vyšší než květy samičí fáze (asi 85%). Květy do 1 m2 (nebo asi pět rostlin) byly pozorovány současně. Bylo provedeno minimálně deset pozorování na populaci (maximálně 16), rozložených na celé populace a v různých časech během dne. Pro každého návštěvníka, jsme zaznamenali druh, počet okraden a unrobbed květiny navštívil na rostlinu a patch, čas strávený na jediný květ, stejně jako jejich potravní chování (pyl nebo nektar kolekce, legitimní nebo nelegitimní navštívit, označované jako okrádání (základní-pracovní, primární a sekundární okrádání). Během 530 min pozorování květin v roce 2011 a 400 min v roce 2012 jsme zaznamenali 183 návštěvníků květin. Čmeláci (B.pascuorum a B. hortorum) a včely medonosné (Apis mellifera) byli hlavními návštěvníky květin; byly pozorovány pouze 3 jedinci B. terrestris.

nosnost pylu

třicet jedinců na druh bylo zabito ethylacetátem a jednotlivě zásobeno. Pyl byl odstraněn z různých částí těla hmyzu malými kostkami želatiny-glycerinu53. Pylová zrna koncentrovaná v corbicule byla odstraněna a nebyla zahrnuta do analýz. Všechna pylová zrna byla počítána světelnou mikroskopií.

čistota sběru pylu

v přirozených populacích jsme odebrali vzorky pylové zátěže od čmeláků navštěvujících a. napellus. V laboratoři byla pylová zátěž acetolyzována 53. Nejméně 400 náhodně vybraných pylových zrn každé z 25 pylových zátěží bylo identifikováno a započítáno pod světelnou mikroskopií.

chuťové reakce návštěvníků hmyzu

řídili jsme se protokolem Ma et al.54 pro detekci akonitinu. Když chytil, jednotlivé včely byly hladověl po dobu 3 hodin v plastové lahvičce (7 cm dlouhý, 2,8 cm vnitřní průměr) při teplotě místnosti a v úplné tmě v laboratoři. Jsme převedli každá včela do hospodářství zkumavky, 15 mL centrifugační zkumavky s 4 mm otvory vyvrtané na špičce a kus ocelové pletivo pevně uvnitř. Po pre-zkušební fáze s kapičky sacharóza, jsme představili zkušebního roztoku ve 100-µL skleněná kapilární trubice a jemně stiskl trubky udržovat roztok na špičce trubice. Jakýkoli hmyz bez prodloužení proboscis po 5 minutách byl z testu odstraněn. Zkušební fáze byly dlouhé 2 minuty a objem roztoku před a po zkoušce byl zaznamenán pomocí třmenu.

byly provedeny testy se třemi druhy návštěvníků (a. mellifera, B. pascuorum a B. terrestris). S každým roztokem bylo testováno deset jedinců na jeden druh hmyzu. Koncentrace sacharózy (430 µg mg-1) a akonitinu (232 µg g−1) odpovídaly koncentracím nalezeným u našeho druhu. Byly předloženy tři roztoky: samotná deionizovaná voda (kontrola), čistý roztok sacharózy a roztok sacharózy plus akonitinu.

pro všechny testy byl pro každého subjektu vypočítán odstrašující index od volby pití, objemu spotřebovaného roztoku a doby kontaktu s roztokem následovně: ID = 1- (volba pro sacharóza/volba pro sacharóza + akonitin) × (objem spotřebované sacharózy/objem spotřebovaného sacharózy + akonitin) × (doba kontaktu s roztoku sacharózy/doba kontaktu s sacharóza + akonitin řešení).

Statistické analýzy

normalita dat byla odhadnuta pomocí Shapiro–Wilk tests, a homoskedasticity byla ověřena pomocí Levene testy. Když byly splněny požadavky na normálnost a homoscedasticitu, byly provedeny analýzy rozptylu (ANOVAs) (účinek květinové fáze na květinové těkavé látky). Jinak, neparametrické testy byly provedeny pomocí Wilcoxonův test pro srovnání dvou podmínek (květinové fáze efekt na květ morfologie a nektar parametry) a Kruskall-wallisova testu pro porovnání více než dvou podmínek (hmyz a řešení vliv na spotřebované množství a trvání kontaktu s roztokem v chuťové experimenty, hmyzu účinek na návštěvu chování) a chí-kvadrát testy byly provedeny pro porovnání procenta jednotlivců v chuťové experimenty. ANOVA a neparametrické analýzy byly následovány vícepárovým porovnáním, když byly porovnány více než dvě podmínky. Všechny analýzy byly provedeny v SAS Enterprise Guide 7.1. Údaje jsou prezentovány jako prostředky ± směrodatné odchylky.