Mobilní Fáze

mobilní fáze chromatografie s reverzní fází je směs vody nebo pufru s polární organická rozpouštědla jako jsou methanol, acetonitril, isopropanol (IPA), nebo tetrahydrofuranu (THF). Eluční síla se v tomto pořadí zhruba zvyšuje. Alkoholy jsou dárci protonů, zatímco acetonitril je akceptor protonů. Směsi acetonitrilu a vody mají nižší viskozitu ve srovnání se směsmi ostatních rozpouštědel s vodou. To má za následek nižší protitlak. Směsi IPA / vody mají nejvyšší viskozitu. Vzhledem k nižšímu protitlaku, který je výsledkem nižší viskozity, jsou dva běžně používané organické modifikátory mobilní fáze acetonitril a methanol. Také acetonitril má nízkou absorpci v nízkém UV záření, mnohem méně než ostatní rozpouštědla.

voda je nejslabší eluent v chromatografii s obrácenou fází. Přidání methanolu nebo acetonitrilu snižuje retenci. Logaritmus retenčního faktoru klesá zhruba úměrně s koncentrací organického rozpouštědla. Pokud je analytem malá molekula, jako je tomu u většiny léčiv, retence se sníží zhruba sedminásobně, když se koncentrace methanolu v mobilní fázi zvýší asi o 20%. Při vývoji metody) se předpokládá, že existuje lineární vztah mezi logaritmem retenčního faktoru a objemovou frakcí organického modifikátoru v mobilní fázi. Mělo by se to však považovat pouze za dobré pravidlo, které není přesné ani teoreticky ospravedlnitelné.

Vzhledem k solvatační vlastnosti acetonitril v porovnání s methanolem, nahrazení jednoho rozpouštědla s ostatními často vede ke změně v eluční pořadí analytů (Obrázek 2). Proto se tato technika často používá při vývoji metod. Změna z jednoho modifikátoru na jiný vytváří významnější změny selektivity než změna samotné pevnosti rozpouštědla (tj. změnou koncentrace organického rozpouštědla). THF také drasticky mění selektivitu. Ve skutečnosti jsou největší změny selektivity často způsobeny nahrazením methanolu nebo acetonitrilu THF. Z několika důvodů, jako je nepříjemný zápach, tvorba peroxidů a nepříznivá UV průhlednost, se však nepoužívá příliš často.

Obrázek 2. Vliv modifikátoru mobilní fáze na selektivitu separace. Horní, acetonitril; spodní, methanol. Kolona: XTerra RP18, 4,6 mm×50 mm, 3,5 µm. Gradient na 2 ml min−1 15 min z 0 na 80% organické při pH 3 s mravenčanu amonného. Analyty: 1, triamteren; 2, chlorthalidon; 3, althiazid; 4, furosemid; 5, benzthiazid; 6, probenecid; 7, kyselina ethakrynová; 8, bumetanid; 9, kyselina kanrenová. (Chromatogram poskytnutý Diane Diehl a Kim Tran, Waters Corporation.)

výklad rozpouštědel, selektivita je komplikován skutečností, že organické rozpouštědlo je adsorbována na stacionární fázi ligandů a může být považována za součást stacionární fáze. V poslední době několik autorů se měří na povrchu přebytek organické modifikátory pro standardní C18-typ stacionární fáze a zjistili významné rozdíly v povrchové solvatační mezi acetonitril a methanol.

na začátku tohoto oddílu bylo uvedeno, že methanol poskytuje vyšší retenci než acetonitril. To je ještě výraznější u ionizovaných sloučenin než u neionizovaných sloučenin. To dává smysl z hlediska, že adsorbovaný methanol ve stacionární fázi usnadňuje pronikání ionizovaných molekul do stacionární fáze. Stejný vzorec se vyskytuje při porovnání methanolu s THF. Jedná se o užitečné funkce při vývoji metod. Na druhé straně sloučeniny se sulfonamidovými funkčními skupinami vykazují relativně větší retenci v THF ve srovnání se skupinou referenčních analytů. Celkově významný vliv organického rozpouštědla na selektivitu separace může být pozorován, ale racionalizace je obtížné, protože rozpouštědlo lze nalézt v obou stacionární a mobilní fázi. Někteří autoři se také pokusili odlišit mobilní fáze s vysokým obsahem vody od fází s nízkým obsahem vody.

Jak bylo uvedeno výše, významné rozdíly selektivity mezi různými rozpouštědly jsou velmi užitečným nástrojem v rozvoji reverzní fáze separace. Schémata vývoje klasických metod používají methanol, acetonitril a THF jako organické modifikátory v mobilní fázi. Mezilehlé selektivity mohou být získány se směsmi rozpouštědel a lze bez obtíží provést úpravu odstupu špiček. Moderní schémata vývoje metod používají teplotu jako další snadno regulovatelnou proměnnou při úpravě selektivity.

důležitým aspektem mobilní fáze selektivita je její pH. Kontrola uchovávání ionizovatelné sloučeniny s pomocí pufry nebo kyseliny nebo báze přísad do mobilní fáze je velmi důležité. Uvážlivým výběrem pH v mobilní fázi lze usnadnit manipulaci s retencí a selektivitou. Jak bylo uvedeno výše, rozdíl v retenci mezi ionizovanou a neionizovanou formou analytu může být 10 až 30krát a kontrola pH je důležitá.

v posledních letech výzkum ukázal, že jak pH, tak ionizační konstanty pufru se mění, když se k němu přidávají organická rozpouštědla. To má důležité důsledky pro kontrolu retence. Obvykle se lze dostat k definované ionizaci analytu, pokud je pH mobilní fáze ±2 jednotky pH od pKa analytu. Pokud se však pH a analyt pKa mění přidáním organického rozpouštědla, není snadné se s tím vypořádat pomocí jednoduchých pravidel. Proto je dobrá kontrola pH a dobrý pufr důležitými prvky reprodukovatelnosti separace ionizovatelných analytů v obrácené fázi. PH se měří ve vodě, kde je člověk obeznámen s hodnotami pKa běžně používaných pufrů a dává přednost tomu, aby zůstal blízko těchto hodnot pKa. Maximální kapacita vyrovnávací paměti se nachází na pKa vyrovnávací paměti. Zatímco pH se mění v přítomnosti organického rozpouštědla, kapacita pufru není. Pro lékaře chromatografie s obrácenou fází je to důležitý aspekt kontroly retence. Na druhé straně musí být vyšetřovatel retenčních mechanismů v obrácené fázi připraven měřit pH v přítomnosti organického rozpouštědla, aby plně porozuměl jeho vlivu na retenci. Přidání organického rozpouštědla obvykle vede ke zvýšení pKa kyselin a ke snížení pKa pro báze. To platí jak pro pufry, tak pro analyty. To může mít za následek významný posun v očekávaném ionizačním vzoru analytu. Zde je příklad, který to ilustruje: Amin s pKa 9 je zcela ionizován ve fosfátovém pufru při pH 7 ve vodě, ale může být pouze napůl ionizován ve stejném pufru po přidání 70% methanolu. Je zřejmé, že tyto účinky jsou významné. Přesný způsob přípravy pufru a řízení jeho pH je proto nezbytný pro dobrou kontrolu retence ionizovatelných analytů v obrácené fázi.

jiné iontové interakce ovlivňují také retenci a selektivitu separace ionizovaných analytů v obrácené fázi. Klasickým nástrojem pro zvýšení retence iontových analytů je iontová párová chromatografie. V této techniky, stacionární fáze se vyrovnává s hydrofobní nabitých iontů, jako jsou dlouhé řetězce kyseliny sulfonové ion (např. octylsulfonate) nebo hydrofobní kvartérní amin (např. tetrabutylammonium ion). Typické mobilní fáze koncentrace je kolem 10 mM. Přídavek ion-pair činidla do mobilní fáze, zvyšuje retenci cíl ionty, snižuje zadržování iontů stejný náboj jako ion-pair činidla, a ponechává retence neutrálních analytů včetně zwitterions téměř nedotčena. Je tedy vynikajícím nástrojem pro nastavení selektivity separace. Důvodem těchto změn selektivity je skutečnost, že činidlo s iontovým párem je adsorbováno na povrch stacionární fáze. Nejjednodušší interpretací výsledného retenčního mechanismu je kombinace iontové výměny s mechanismem obrácené fáze. Jak se zvyšuje koncentrace činidla iontového páru v mobilní fázi, zpočátku se zvyšuje retence opačně nabitých analytů a poté se vyrovnává při vyšších koncentracích. U činidel s iontovým párem s různou délkou řetězce se retence zvyšuje rychleji s delší délkou řetězce.

dalším účinkem interakce iontů s kationtovými analyty je zvýšení retence, když se do mobilní fáze přidávají malé anorganické protiionty. Požadované koncentrace jsou obvykle asi 10krát vyšší než koncentrace používané s činidly s iontovými páry. Typickými anionty tohoto typu jsou chloristan (ClO4 -), tetrafluorborát (BF4−) nebo hexafluorofosfát (PF6−). Významně zvyšují retenci kationtových analytů. Účinek je výraznější u acetonitrilu jako přísady v mobilní fázi než u methanolu. To je vysvětleno silnější vrstvou acetonitrilu adsorbovaného na stacionární fázi ve srovnání s monomolekulární vrstvou methanolu a rozdělením proti iontu do této vrstvy. Z pohledu uživatelů není retenční chování kationtových analytů v přítomnosti těchto anorganických aniontů odlišné od chování pozorovaného u skutečných činidel s iontovým párem, tj.