Diagnostika

Klinická diagnóza: Klinický obraz u pacientů, kteří trpí chlamydiové infekce může být zavádějící, protože až na 70-80% infikovaných žen a 50% infikovaných mužů jsou asymptomatické. Typicky, žena s nekomplikovanou chlamydiovou infekcí bude mít bez zápachu, mukoidní vaginální výtok bez svědění. Dysurie bez frekvence nebo naléhavosti bude stěžována, pokud se jedná o močovou trubici. Dále, v PID, historie, silná bolest břicha s vysokou horečkou, dyspareunie, prodloužené menstruační cykly a intermenstural krvácení může být dosaženo. Při vyšetření je z os vidět cervicitida se žlutým, zakaleným mukoidním výbojem. Cervix má tendenci snadno krvácet, když je oškrábán špachtlí nebo štětcem. Vyšetření moči odhalí přítomnost >5 WBC/HPF (high power field), které je sugestivní urethritis13. Chlamydiové infekce nelze klinicky odlišit od jiných uretrálních infekcí. Aminový test (tj., významné uvolňování pachu po přidání KOH k vaginální sekreci) může pomoci odlišit chlamydiové infekce od jiných infekcí dolních pohlavních cest, ale má nízkou specificitu.

Chlamydiové infekce u mužů se projevuje jako zánět močové trubice u 15-55% ovlivněna méně než nebo rovno 35 yr, občas epididymitidy může být seen2. Mírný až střední čirý až bílý výtok z močové trubice je pozorován ráno před vyprázdněním pacienta. U epididymitidy může být v anamnéze vyvolána jednostranná bolest varlat se skrotálním erytémem, citlivost nebo otok nad epididymis. Diagnóza může být stanovena na základě přítomnosti mukopurulentní výtok z penisu, který na Gram barvení ukazuje >5 WBC/HPF a absence intracelulární gramnegativní diplokoky. Reiterův syndrom může být vzácnou komplikací neléčené chlamydiové infekce. Reaktivní artritida, která zahrnuje triádu uretritidy / cervicitidy u žen, konjunktivitidu a bezbolestnou mukopurulentní erupci na dlaních a chodidlech, je pozorována u Reiterova syndromu29. Ženy jsou častěji postiženy než muži. Existuje asymetrické vícenásobné zapojení kloubů s předností dolních končetin.

Laboratorní diagnostika: asymptomatická povaha onemocnění a rostoucí spektrum infekcí způsobených C. trachomatis zdůrazňují potřebu citlivých a spolehlivých laboratorních metod.

Znalost sběru a transportu vzorků je rozhodující pro přesnost diagnostického testování. Ukázalo se, že citlivost i specificita diagnostických testů na C. trachomatis přímo souvisí s přiměřeností vzorku. Hostitelské buňky, které harbour organismu by měly být zahrnuty ve vzoru kolekce jako chlamydiae jsou obligátní intracelulární patogeny, zejména v technikách zahrnujících přímé vizualizace organismu.

výběr míst odběru vzorků může ovlivnit pravděpodobnost obnovení patogenu. 10-20% zvýšení využití C. trachomatis z genitálního traktu byla pozorována, pokud oba cervikální a uretrální vzorky se odebírají ve srovnání s krční vzorků only42. Endocervikální výtěr, vaginální/introital tampon, vulvy výtěr, stejně jako močové trubice a rekta tampon a první úlovek moči jsou běžné vzorky odebrané od pacientek. Uretrální a rektální výtěr a vzorek moči prvního úlovku lze také odebrat od mužských pacientů kromě jiných specifických vzorků, jako je prostatická tekutina.

zajištění kvality odběru a transportu vzorku: přiměřenost vzorku lze určit vizualizací squamo-sloupcových buněk během mikroskopie. Vzorek se považuje za přiměřený, pokud obsahuje jednu sloupcovou / metaplastickou buňku na sklíčko. Pravděpodobnost, že izolace je optimalizovaná, pokud exemplář je v chladu, ihned po odběru při teplotě 2-8°C. doba mezi vzorku, sběr a zpracování by měly být v ideálním případě méně než 48 hodin, pokud to není možné tyto mohou být zmraženy na -70 °C až do processed16. Fetální bovinní sérum (2-5%) pomáhá zachovat životaschopnost chlamydií ve vzorku, který má být zmrazen. Nejčastěji používaným transportním médiem je dvoumolární fosforečnan sacharózy (2-MSP)nebo glutamát fosfát sacharózy. Syntetické doprava média pro kulturu a některé non – kultura testy byly vyvinuty a schváleny pro diagnostické použití, tj. M4 transportní médium, Flex Trans střední a nové M4 syntetický/univerzální médium.

laboratorní diagnostika Chlamydií se skládá z následujících metod:

(i) Specifické testy

Buněčné kultury: Izolace organismu je definitivní metoda pro diagnostiku chlamydiové infekce. Chlamydie je povinný intracelulární patogen, a proto vyžaduje kultivaci embryonovaných slepičích vajíček nebo živočišných buněčných linií. Takové kultivační metody jsou technicky obtížné, náročné na pracovní sílu, těžkopádné a drahé a nebyly široce přijaty jako rutinní test prováděný ve všeobecných klinických laboratořích. Pro kultivaci chlamydiae viz byly však použity tři systémy in vitro. myš očkování (intraperitoneální, intrakraniální a intravenózní), žloutek sac-očkování (7-8 den staré chick embryo žloutkový váček očkování) a buněčné kultury lines16. Mezi nejčastěji používané buněčné linie patří-buňky HeLa 229, buňky McCoy, buňky BHK21 a bgmk24.

citlivost buněčné kultury pro izolaci chlamydiae je posílena pre-léčba cele polycations, DEAE-dextrany, odstřeďování inokula na buněčné monovrstvy a začlenění anti-metabolity, jako jsou cycloheximide nebo cytochalasin B do buněčné kultury medium42. Buněčná jednovrstvá pro kultivaci C. trachomatis se pěstuje v bubnových nebo skořápkových lahvičkách na skleněných víčkách nebo v jamkách multiobuněčných kultivačních misek. Metoda obalové lahvičky je pro klinický vzorek citlivější než multiobuněčná kultura kvůli menší šanci na křížovou kontaminaci42. Před inokulací by měl být vzorek sonikován, aby narušil hostitelské buňky a oddělil chlamydiové inkluze. Pro naočkování buněčných kultur by mělo být nadložní kultivační médium odstraněno a nahrazeno dostatečným množstvím vzorku v kultivačním transportním médiu, aby se pokryla monovrstva a zabránilo se vysychání.

nejčastěji používané růstové médium je Eagles Minimální Esenciální Medium (EMEM), doplněné aminokyseliny a vitamíny, fetální telecí sérum (5-10), extra glukózy (0.056 m) a 2-glutamine42. Po inokulaci se kultury inkubují při 37o C po dobu 2-3 dnů. Chlamydiové inkluze jsou pak pozorovány imunofluorescenčním barvením. Ukázalo se, že citlivost izolace se pohybuje v rozmezí 70-85 procent v závislosti na použité laboratoři a kultivačním systému. Tradičně se jedná o „zlatý standard“ pro diagnostiku C. trachomatis, protože je to 100% specifické42. Bohužel je mimo možnosti většiny soukromých a veřejných laboratoří kvůli své technické poptávce, náročnosti práce a vysokým nákladům.

přímý fluorescenční test (DFA): Test DFA přidává značnou výhodu barvení protilátek specifických pro chlamydie k přímému vyšetření vzorku a zůstává jednou z nejužitečnějších diagnostických technik. V tomto testu, rychlá identifikace základních orgánů v nátěrech s fluorescentní isothiocynate – konjugované monoklonální protilátky (FITC-Mab) proti MOMP nebo rodu konkrétní LPS jsou používány. Základní subjekty se objeví jako zřetelný, ostře uvedeno, zelené jablko, disk ve tvaru (300 nm) částice a reticulate těla se objeví asi tři krát větší než základní instituce, které mají fluoreskující halo.

tento postup nevyžaduje přísné podmínky pro přepravu vzorků, protože je připraven a následně transportován ke zpracování stěr z lože. Při použití MOMP C. trachomatis citlivost a specificita DFA je zjištěno, že 80-90 procent a 98-99 procent, respektive ve vztahu k kultuře43. Vysoká specificita DFA je přičítána jeho závislosti na vizualizaci charakteristické morfologie a barvicích charakteristik chlamydiových inkluzí. DFA je jediným dostupným diagnostickým testem, který umožňuje současné posouzení přiměřenosti vzorku vizualizací epiteliálních buněk přítomných v nátěru. Je to rychlé a jednoduché (doba obratu asi 30 min), ale mikroskopické vyšetření a interpretace výsledků vyžaduje odborné znalosti. Tato metoda se proto doporučuje pro laboratoře s nízkým objemem. Tento test lze použít také na extragenitální místa. Uvádí se, že je citlivější než kultura pro detekci chlamydií ve vzorcích endometria nebo vejcovodů42.

ELISA (enzymově vázaný imunosorbentní test): ELISA je k dispozici pro detekci antigenu C.trachomatis. Pro tento účel je k dispozici několik komerčně dostupných souprav ELISA. Většina z nich detekuje chlamydiové LPS, které jsou rozpustnější než MOMP. Bylo hlášeno, že testy enzymové imunoanalýzy (EIA) mají citlivost 62-96% a specificitu 86-99% ve srovnání s buněčnou kulturou44. Tento test je vhodný pro laboratoře bez přístupu k buněčné kultuře. Nicméně, různých velkých a malých studií po celém světě, včetně Indie uvádějí, špatná citlivost ELISA ve srovnání s DFA a PCR45,46,47.

cytologie: cytologie je snadno dostupný, snadno použitelný a nákladově efektivní diagnostický test. Nevyžaduje bezpečnostní opatření pro skladování a přepravu vzorků a mohou být také detekovány neživotaschopné / neinfekční částice. Kvalitu klinického vzorku lze posoudit mikroskopickou technikou a technické postupy použité v těchto testech jsou obvykle rychlejší a jednodušší než kultivace. Nejčastěji se používají metody Giemsa, imunoflourescence a barvení jódem. Jiné skvrny, jako imunoperoxidázovými, immunoferritin, Může Grunwald, Giemenez, Macchiavello a akridin oranžová může být také použit pro detekci chlamydiové inkluze v exfoliovaných buněk. Přítomnost intracytoplazmatická inkluze je pathogonomic pro chlamydiové oční infekce u novorozenců, nicméně, tato metoda se nedoporučuje pro diagnostiku zánět spojivek nebo genitální infekce u dospělých vzhledem k nedostatku citlivosti. Ze tří metod nabízí imunofluorescence nejvyšší citlivost následovanou barvením Giemsa a poté jódem42.

molekulární metody: Tradiční metody diagnostiky mají několik omezení, která zahrnují nízkou citlivost, dlouhou dobu testování a vysoké náklady. Proto jsou navrženy testy založené na přímém rozpoznávání sekvencí DNA a RNA. Komerčně dostupné DNA sondy pro detekci Chlamydia je TEMPO 2 test (Probe Assay Enhanced Chemiluminiscence)48, který je schopen detekce Neisseria gonorrhoeae také, což je non-izotopové DNA sondy pro detekci specifických částí r-RNA C. trachomatis v endocervikální a uretrální vzorku. Byla také vyvinuta další dna sonda PACE 2C test, která současně detekuje jak C. trachomatis, tak N. gonorrhoeae z jediného vzorku; před jeho použitím v diagnostice je však nutné další vyhodnocení PACE 2C. Tyto testy používají chemiluminiscenční dna sondu, která hybridizuje s druhově specifickou sekvencí chlamydiové 16S rRNA. Jakmile je vytvořen hybrid DNA-rRNA, je adsorbován na magnetickou perličku a chemiluminiscenční odpověď je kvantitativně detekována luminometrem. Protože aktivně dělicí chlamydie obsahují až 104 kopií 16S rRNA, měl by být test PACE 2 teoreticky citlivější než systémy detekce antigenu. Citlivost PACE 2 vzhledem ke standardu amplifikace DNA nebyla dosud dobře hodnocena, ale bylo hlášeno, že je 77 až 93 procent48 v jedné studii.

Na vypracování testů na základě amplifikace nukleových kyselin technologie (NAAT), byl nejvíce důležitý pokrok v oblasti chlamydií diagnózu, protože in vitro buněčné kultury, techniky nahrazuje žloutkový váček pro kulturu a izolaci organismu z klinických vzorků. NAAT je nejméně o 20-30% citlivější (schopný detekovat jen jednu genovou kopii) a o 100% specifický49, 50. To nabízí možnost využít neinvazivní vzorky moči na obrazovku pro infekce u asymptomatických jedinců, kteří by normálně vyhledat lékařskou péči. To je kritická výhoda, protože většina chlamydiových infekcí u žen a významná část infekcí u mužů jsou asymptomatické. Nejznámější z technologií amplifikace DNA je PCR. PCR může být rod, druh, skupina, nebo kmen specifický v závislosti na konstrukci primeru. Geny cílené pro diagnostiku C. trachomatis jsou Gen MOMP, endogenní plasmid, Gen fosfolipázy A Gen rRNA 16S a 23S. Protože všechny technologie amplifikace nukleových kyselin detekují cíle nukleových kyselin, nezávisí na životaschopnosti ani neporušeném stavu cílového organismu pro pozitivní výsledek. Přeprava vzorku tedy není kritickou otázkou. I když to nebylo dobře studoval, „okno“ pro kulturu-negativní, PCR pozitivní stav po terapii doxycyklinem se zdá trvat až 3 wk29. Po této době se vzorky pacientů stávají kulturou i PCR negativními.

PCR test pro detekci C. trachomatis vyvinutý společností Roche Diagnostics, Basel Switzerland (Roche-Amplicor) byl prvním PCR testem schváleným FDA ve Spojených Státech51. Od roku 1993 byla Amplicor PCR relativně dobře hodnocena jak u urogenitálních, tak u vzorků moči, s celkovou citlivostí a specificitou 90 a 99 až 100%, respektive 51. Amplicor PCR je schválen pro vzorky cervikální, mužské uretry a mužské moči.

S explozí technik molekulární biologie novější testy jako m2000 systém (Abbott), stejně jako strand-displacement amplification (SDA) (BD ProbeTec pramen posunutí zesílení vyvinut Becton Dickinson a Company, Diagnostické Systémy, Franklin Lakes, N. J.) a transkripce-mediované amplifikace (TMA) (APTIMA systému Gen-Probe Inc., San Diego) se stal dostupným pro C. trachomatis. Přestože jsou ve vyspělých zemích populární, jejich vysoké počáteční náklady a náklady na údržbu brání jejich použití v prostředí s nedostatkem zdrojů.

břemeno C. trachomatis organismů v genitálním traktu (chlamydiové zátěže) mohou být zjištěny pomocí kvantitativní real-time PCR a může se lišit od 10 do více než milion organismů/ml genitálního traktu secretions52. To pravděpodobně ovlivní výkon různých testů amplifikace nukleových kyselin, které běžně nerozlišují mezi lidmi s vysokou a nízkou chlamydiovou zátěží. Rozdíly v chlamydiové zátěže byly hlášeny být spojena s přítomností klinických příznaků, přenosnost a přetrvávání infekce a riziko vzniku chronických sequelae53. Proto existuje kritická role kvantifikace v diagnostice a léčbě chlamydiových infekcí.

Naat jsou nejcitlivějšími testy pro screening a diagnostiku chlamydiových a gonokokových infekcí genitálního traktu54, 55, 56. Jsou však hlášeny pochybnosti o jejich výkonu v oblastech s nízkou prevalencí 57, 58. V roce 2002, CDC doporučuje potvrdit všechny pozitivní Naat pro C. trachomatis, kdy pozitivní prediktivní hodnota testu je <90% cent59. Je však zjištěno, že skutečné specifika metod NAAT jsou > 99% 54, 55.

CDC má také navrhl několik možných strategií pro confirmation59, které zahrnují (i) testování druhého vzorku s jiným NAAT mít stejnou nebo vyšší citlivost na první test, (ii) provádění různých NAAT mít stejnou nebo vyšší citlivost na první test zaměřený na různé sekvence nukleové kyseliny na původní vzorek, (iii) opakování původní test na původním vzorku, a (iv) uvedení pacienta zpět na přezkoušení.

Nicméně, omezení popsané jsou, že většina lékařů nebude sbírat dva vzorky o stejné hodnocení, ani je to možné přivést zpět pacienta, aby sbírat další vzorek, a většina laboratoří nemají zařízení / schopnost provádět dva různé testy Naat.

koncept konfirmačního testování není nový57. Nicméně; komplikuje manipulaci s pozitivním vzorkem NAAT a zvyšuje náklady na již nákladný screeningový test. Také stále existuje prostor pro zlepšení citlivosti Naat, možná lepší přípravou vzorků, automatizací nebo cílovou koncentrací.

(ii) nespecifické testy

test leukocytární esterázy (LE) je rychlý test měrky pro použití se vzorky moči. Tento test je určen k detekci infekcí močových cest detekcí enzymu produkovaného polymorfonukleárními (PMN) buňkami. Pozitivní výsledky le testu se vyskytují u infekcí způsobených řadou různých látek, včetně C. trachomatis a N. gonorrhoeae.

citlivost LE testu na detekci infekce C. trachomatis se značně liší od 31 do 100 procent a specifika se pohybují od 83 do 100 procent60. LE test byl považován za nejlepší screeningový test u dospívajících mužů a podle většiny zpráv by neměl být používán pro testování vzorků od žen nebo starších mužů kvůli neuspokojivému výkonu.

(iii) Rychlý point of care (POC) testů,

Rychlé testy, nazývané také „point-of-care“ testy pro C. trachomatis zaměstnávají EIA technologie ve formátech založen především na membránové zachytit nebo latex immunodiffusion. Rychlé testy se provádějí v ordinacích lékaře, nevyžadují sofistikované vybavení a mohou být dokončeny přibližně za 30 minut. Výsledky jsou čteny vizuálně a jsou tedy kvalitativní. Ačkoli několik sad je komerčně dostupných, ale žádný nebyl dobře hodnocen. Obecně jsou rychlé testy výrazně méně citlivé a specifické než laboratorně prováděné EIA. Ve srovnání s PCR byla citlivost a specificita testu Clearview (Unipath Ltd., UK) bylo 53.8 a 99.1 procent, respektive, s vzorky endocervikálních výtěrů, a 31.1 a 95.2 procent s vzorky vaginálních výtěrů od filipínských žen61. Rychlé testy nabízejí výhodu oproti konvenčním laboratorním testům pouze tehdy, jsou-li výsledky vyžadovány okamžitě pro léčbu pacientů. Rychlé testy by neměly být používány u populace s nízkou prevalencí nebo u asymptomatických jedinců kvůli potenciálu falešně pozitivních výsledků. Výsledky rychlého testu by měly být vždy považovány za podezřelé, a pokud je pozitivní, by mělo být potvrzeno v laboratoři provádí test.

Závěrem lze říci, že ačkoli je kultura 100% specifická, její odhadovaná citlivost může být až 50%. Většina laboratoří se pohybovali pryč od kultury vzhledem k výdajem, čas a technické problémy. Tedy, místo kultury jako diagnostický zlatý standard, rozšířené zlatý standard/definovanými referenční standard, tj. běžně konzistentní výsledek se dvěma non-kultury, techniky, je považováno za užitečné, jako je výzkum tool43.

(iv) sérologie

sérologické testy nejsou obecně užitečné při diagnostice infekcí genitálního traktu způsobených C. trachomatis. Protilátky vyvolané C. infekce trachomatis má dlouhou životnost a pozitivní test na protilátky nerozlišuje předchozí od současné infekce.