GDF11PRO-Fc váže na oba GDF11 a MSTN

ukázat, že GDF11PRO-Fc mohou vázat na aktivní zralý GDF11 dimery prostřednictvím přímé interakce, jsme zaměřené na identifikaci protein-protein interakce mezi GDF11 a GDF11PRO-Fc. Navíc, vzhledem k úzké strukturní homologii zralých dimerů GDF11 a MSTN, chtěli jsme také určit, zda se GDF11PRO-Fc spojuje s MSTN. K identifikaci těchto interakcí protein-protein jsme provedli sadu pull-down testů (obr. 1). Ligandů rGDF11, rMSTN, a rActivin byly inkubovány s lyzátu frakce z HEK293 buněk transfektovaly s plazmid kódování pro GDF11PRO-Fc nebo MPRO-Fc při pH 7.4. Vzhledem k konjugované Fc fragmenty na upravené propeptidy, zlomky mohla být stržena přímo na protein A/G agarózy pryskyřice. Jak se očekávalo, GDF11PRO-Fc účinně stáhl rGDF11 i rMSTN, což naznačuje, že GDF11PRO-Fc byl schopen vázat oba ligandy. Kromě toho MPRO-Fc úspěšně stáhl rGDF11 i rMSTN. Oba GDF11PRO-Fc a MPRO-Fc nebyli schopni strhnout více vzdáleně souvisí TGF-β nadčeleď ligand rActivin, což naznačuje, že vazba ligandu je specifické (Obr. 1). Na kontrolní agarózové pryskyřici bez proteinu a/G nebyla pozorována žádná vazba GDF11PRO-Fc, MPRO-Fc, rGDF11, rMSTN nebo ractivinu a. Z těchto výsledků jsme došli k závěru, že GDF11PRO-Fc spontánně spojuje s zralé GDF11 a MSTN dimery při fyziologickém pH.

GDF11PRO-Fc společníci s GDF11 a MSTN. Protein-Protein interakce mezi GDF11PRO-Fc nebo MPRO-Fc a rGDF11, rMSTN, nebo rActivin A byly určeny pull-down assay. GDF11PRO-Fc nebo MPRO-Fc byl inkubován s rGDF11, rMSTN nebo rActivin A po dobu 1 hodiny při 4 °C. Fc-tavený proteinové komplexy byly odděleny na protein A/G potahované agarózového pryskyřice a eluáty byly běh na 12% SDS-PAGE gel pod redukční podmínky a sondovali western blot. Řízení vstupu bylo 5% vstupního materiálu. WB western blot

GDF11PRO-Fc bloky GDF11/MSTN vyvolané atrofie v C2C12 myotubes

Přidání rGDF11 a rMSTN rozlišené myotubes již dříve bylo prokázáno, že k vyvolání atrofie v myších C2C12 a primární lidské kosterní myotubes . Poté, co zjistil, že GDF11PRO-Fc váže GDF11 a MSTN, dále jsme se zeptal, jestli GDF11PRO-Fc by mohla zabránit GDF11/MSTN vyvolané myotube atrofie v diferencované C2C12 myotubes. K dosažení tohoto cíle, jsme balené sekvence DNA kódování pro GDF11PRO-Fc do AAV6 kapsidový generovat AAV6-GDF11PRO-Fc vektor. V těchto experimentech, AAV6 vektor byl vybrán pro svou schopnost efektivně a selektivně přenášet diferencované C2C12 myotubes, ale ne myoblastů . Myoblasty C2C12 byly kultivovány a diferencovány po dobu 5 dnů před léčbou AAV6-GDF11PRO-Fc nebo aav6-EGFP (kontrolní vektor)při MOI 105 (obr. 2a). Podle očekávání byla exprese GFP pozorovatelná u myotubů c2c12 infikovaných AAV6-EGFP po 48-72 h po infekci a kvantifikace internalizovaných kopií vektorového genomu na diploidní genom po 72 h po infekci naznačila, že vektorová transdukce byla adekvátně dosažena (obr. 2b a c).

br. 2

GDF11PRO-Fc bloky GDF11/MSTN vyvolané myotube atrofie v C2C12 buněk. schéma popisující experimentální časovou osu v myotubách C2C12. AAV6-EGFP nebo AAV6-GDF11PRO-Fc byl přidán do MYOTUBES C2C12 při MOI 105 v den 5 po diferenciaci a 100 ng / ml rGDF11 nebo rMSTN bylo přidáno 7. den. Myotubes byly obarveny a analyzovány 10. den. B exprese EGFP byla patrná při 48-72 hodinách u myotub C2C12 léčených AAV6-EGFP (MOI 10). Měřítko tyče představuje 50 µm. C počet kopií vektorového genomu na diploidní genom v myotubách c2c12 72 h po přidání AAV6-EGFP nebo AAV6-GDF11PRO-Fc (MOI 10 ). D reprezentativní imunofluorescenční obrazy myotubů C2C12. Myotrubové membrány C2C12 byly vizualizovány barvením anti-dystrofinovou protilátkou (červená). Jádra byla obarvena DAPI (modrá). Vložka ukazuje zvětšenou oblast. Stupnice reprezentují 50 µm (hlavní panel) a 25 µm(vložka panelu). e frakce jader začleněných do myotub (diferenciační index) byla vypočtena a prezentována jako procento kontroly. f průměrný průměr myotrubky vzhledem k řízení a (g) rozložení měření průměru. Pro měření průměru myotube byla každá myotube měřena ve třech bodech po délce myotube a zprůměrována. h počet jader začleněných na myotube. Na experimentální stav bylo analyzováno minimálně 50 myotubů. i pSMAD2 / 3 vzhledem k tSMAD2/3 byl hodnocen western blot. Stejné zatížení proteinem bylo ověřeno barvením Ponceau S a GAPDH byl použit jako Kontrola zatížení. Data představují výsledky ze tří samostatných experimentů. Všechny chybové sloupce představují průměr ± SEM. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; n.s. not significant; compared to AAV6-EGFP-treated control. †p < 0.05; ††p < 0.01; †††p < 0.001; compared to AAV6-EGFP + ligand-treated. pSMAD2/3: phosphorylated SMAD2/3; tSMAD2/3: total SMAD2/3

Forty-eight hours after AAV treatment, rGDF11 or rMSTN was added to the media to a final concentration of 100 ng/ml. Sedmdesát-dva hodin později, myotubes byly fixovány a barveny pro imunofluorescenční analýza pomocí protilátek rozpoznávat dystrofin (tyče 22/rod 23) pro vizualizaci myotube periferní membrány a DAPI skvrny myonuclei (Obr. 2d). Snížení diferenciace indexu, který je definován jako podíl myonuclei začleněna do myotubes, byl pozorován v myotubes léčeni rGDF11 (− 15%, p = 0.0008) nebo rMSTN (− 14%, p = 0.0013) ve vztahu k neošetřené kontrole. Tento účinek byl však tupý u myotubů c2c12 exprimujících GDF11PRO-Fc léčených rGDF11 (- 1, 9%; p = 0.0047, ve srovnání s rGDF11 léčených kontrolou) nebo rMSTN (− 3.0%; p = 0.0040, ve srovnání s rMSTN léčených řízení; Obr. 2e). Kromě toho myotubes C2C12, které byly léčeny AAV6-GDF11PRO-Fc, odolávaly atrofii myotub vyvolané rGDF11 nebo rMSTN. Výrazný pokles průměrné myotube průměr ve srovnání s kontrolou byl zjištěn v myotubes léčeni rGDF11 (− 39%; 0.0002) nebo rMSTN (− 35%; p = 0.0003) ve srovnání s kontrolou. Naopak, myotubes vyjádření GDF11PRO-Fc léčeni rGDF11 (− o 1,8%; p = 0.0005, ve srovnání s rGDF11 léčených kontrolou) nebo rMSTN (− 5.3%; p = 0.0075, ve srovnání s kontrolou ošetřenou rMSTN) byly do značné míry neovlivněny (obr. 2f a g). V samostatném experimentu, GDF11PRO-Fc nebyl schopen, aby se zabránilo rActivin-indukované myotube atrofie, což je v souladu s pozorováním, že GDF11PRO-Fc neváže activin (Další soubor 1: Obrázek S3).

léčba rGDF11 nebo rMSTN byla také spojena s nižším podílem zralých myotub s vyšším počtem myonukleí, což naznačuje inhibici diferenciace myotub. Myotuby s více než 11 myonukleemi tvořily pouze 5,2% (p = 0,0215) a 7,2% (p = 0.0328) myotub analyzovaných v buňkách ošetřených rGDF11 a rMSTN. Ve srovnání s myotubami s více než 11 jádry tvořily 26% myotub analyzovaných v kontrolních myotubách. V myotubes vyjádření GDF11PRO-Fc, které byly ošetřeny s rGDF11 nebo rMSTN, podíl myotubes s více než 11 myonuclei bylo 22% (p = 0.0104, ve srovnání s rGDF11 léčených kontrolou) a 19% (p = 0.0404, ve srovnání s rMSTN léčených kontrolou), respektive (Obr. 2h). A konečně, v souladu s tím, co by se očekávat, že následující GDF11/MSTN signalizace na ActRII, zvýšení fosforylované SMAD2/3 (pSMAD2/3) hladiny proteinů v myotubes léčeni AAV6-EGFP a rGDF11 nebo rMSTN bylo pozorovatelné na western blot 24 h po přidání ligandu (Obr. 2i). Tento nárůst pSMAD2/3 úrovně byl přítomen v myotubes léčeni AAV6-GDF11PRO-Fc, což naznačuje, že GDF11PRO-Fc výraz antagonizes GDF11/MSTN indukované aktivace SMAD2/3 v diferencované myotubes. Celkově tyto výsledky naznačují, že GDF11PRO-Fc byl schopen zabránit atrofii myotube indukované rGDF11 a rMSTN a inhibici diferenciace v buňkách C2C12.

Lokalizované GDF11PRO-Fc výraz vyvolává kosterní svalové hypertrofie u dospělých myší

Dříve jsme prokázali, že systémová AAV vektor-zprostředkované genové dodání GDF11PRO-Fc do novorozených myší vedlo k výraznému zvýšení sazby růst kosterního svalstva . Z této studie však nebylo jasné, zda GDF11PRO-Fc jednoduše zvýšil růst kosterního svalstva nebo skutečně indukoval hypertrofii kosterního svalstva. Navíc nebylo možné určit, zda účinky GDF11PRO-Fc byly zprostředkované místní blokáda GDF11/v MSTN kosterních svalů nebo v případě, že pozorované účinky byly kvůli systémovým modulace GDF11/MSTN. K řešení těchto otázek jsme vyhodnotili dopad intramuskulárního podání aav9-GDF11PRO-Fc u dospělých myší c57bl / 6J. V těchto studiích byla injikována pouze pravá zadní končetina a kontralaterální levá zadní končetina byla použita jako kontrola.

tělesná hmotnost se v průběhu času mírně zvýšila u myší léčených AAV9-GDF11PRO-Fc (+10% po 10 týdnech; p = 0,0418; obr. 3a). Kromě toho, jeden-zadní končetiny-síla stisku normalizované na tělesnou hmotnost byla významně zvýšena v obou končetin testovány individuálně, s větší velikosti účinku pozorovaného v ošetřené pravé straně zadní končetiny (+ 37%; p = 0.0177), i když významné zvýšení normalizované přilnavost pevnost v neošetřené levé zadní končetiny (+ 18%; p = 0.0426) byl také pozorován. Tento rozdíl však nedosáhl významnosti, pokud byly obě zadní končetiny testovány současně (+15%; p = 0,2375; obr. 3b). Deset týdnů po podání vektoru byla pravá zadní končetina viditelně větší u myší léčených AAV9-GDF11PRO-Fc(obr. 3c). U myší léčených AAV9-GDF11PRO-Fc, vlhké tkáně hmotnost injekčně pravé straně tibialis anterior (+ 50%; p = 0.0046) a lýtkového (+ 37%; p = 0.0023) byla výrazně vyšší ve srovnání s léčených vehikulem kontroly. Nebyl statisticky významný rozdíl v hmotnosti mokré tkáně neošetřených zadních svalů na levé straně (obr. 3d). Analýza oblasti Myofiber odhalila nárůst průměrné plochy průřezu myofiberu (+15%; p = 0.0078) v aav9-GDF11PRO-Fc-injektované pravé straně gastrocnemius (obr. 3e a f). MFD distribuční analýza také odhalila posun směrem k větší myofibers na pravé straně lýtkového myši injekčně s AAV9-GDF11PRO-Fc (Obr. 3g), což naznačuje, že lokalizovaná exprese GDF11PRO-Fc vyvolala svalovou hypertrofii. V samostatné skupině, jsme také posoudila dopad lokalizován gen dodání GDF11 tím, že intramuskulární injekce AAV9-GDF11 do pravé zadní končetiny, a výrazné svalové atrofie byla pozorována 10 týdnů po léčbě v vstřikuje zadní končetiny (Další soubor 1: Obrázek S4).

br. 3

GDF11PRO-Fc vyvolává lokalizované kosterního svalstva hypertrofie po intramuskulární gen dodání. 8-týden-staré C57BL/6J myši byly léčeny AAV9-GDF11PRO-Fc (n = 5) nebo vozidlo (n = 5), přes jednostranné intramuskulární injekce do pravé zadní končetiny. Kontralaterální levá zadní končetina nebyla léčena. Myši byly utraceny 10 týdnů po léčbě. průměrná tělesná hmotnost v průběhu času. B síla zadního úchopu se normalizovala na tělesnou hmotnost 10 týdny po léčbě. Zobrazeny jsou měření z jedné zadní končetiny a obou zadních končetin. c reprezentativní hrubé zadní svalstvo. Vstřikovaná zadní končetina je označena černou šipkou. d hmotnost mokré tkáně tibialis anterior a gastrocnemius. e Zástupce imunofluorescenční snímky injekčně pravé straně lýtkového průřezy potřísněné s AlexaFluor-488-konjugovaných WGA vizualizovat myofibers. Stupnice reprezentují 100 µm. f průměrná plocha průřezu myofiberu v injektovaném pravém gastrocnemiu. g myofiber MFD distribuce v injektované pravé straně gastrocnemius. Na jednu myš bylo naměřeno minimálně 500 myofiberů. h Western blot identifikace GDF11PRO-Fc v tkáňové lyzáty z injekčně pravé straně lýtkového a vzorky jater léčených myší. GDF11PRO-Fc nebyl detekovatelný u myší léčených vehikulem. Stejné zatížení proteinem bylo ověřeno barvením Ponceau S a GAPDH byl použit jako Kontrola zatížení. Všechny chybové sloupce představují průměr ± SEM. *p < 0,05; **p < 0.01; n.s. není významná; ve srovnání s vozidlem zacházeno kontrolu. TA tibialis anterior, Plynu gastrocnemius

Western blot analýza ukázala, že GDF11PRO-Fc protein byl vyjádřen v AAV9-GDF11PRO-Fc-injekčně pravé straně lýtkového (58 kDa kapely; Obr. 3h). Nicméně, GDF11PRO-Fc není zjistitelný v neošetřené levé straně lýtkového ve stejné celkové množství bílkovin naloženo, což naznačuje, že většina kosterních svalů GDF11PRO-Fc výraz byl lokalizován na injekci pravé straně zadní končetiny (údaje nejsou uvedeny). GDF11PRO-Fc byl také detekovatelný v játrech western blot, což naznačuje, že došlo k určité systémové expozici (obr. 3h). Toto pozorování lze s největší pravděpodobností připsat vaskulárnímu úniku vektoru aav9 do systémové cirkulace z místa injekce . Z těchto údajů zjistíme, že GDF11PRO-Fc indukuje hypertrofii kosterního svalstva u dospělých myší. Tyto účinky jsou navíc alespoň částečně zprostředkovány lokální blokádou GDF11 / MSTN na kosterní svalstvo, pravděpodobně prostřednictvím inhibice interakcí ligandu s ActRII na kosterní svalové tkáni.

Systémové GDF11PRO-Fc gen dodání zvyšuje kosterní svalové hmoty a síly u mdx myší

Next, jsme hodnotili vliv systémové GDF11PRO-Fc výraz v mdx myší k určení, pokud GDF11PRO-Fc může také vyvolat hypertrofii a zvýšení pevnosti v dystrofie kosterních svalů. Pro účely této studie, GDF11PRO-Fc konstrukt byl upraven s mutací k tomu, aby se odolný vůči endogenní BMP1/TLD-jako metaloproteinázy štěpení (GDF11PRO-Fc D122A) a zvýšit faktor persistence v systémové cirkulaci . Pro tyto experimenty, jak AAV9-GDF11PRO-Fc a AAV9-GDF11PRO-Fc D122A byly vyhodnocovány k zjištění, zda zmutoval D122A transgenu by vést k výraznější účinek in vivo. K dosažení systémové exprese byly myši mdx léčeny vektorem nebo vehikulem injekcí ocasní žíly. Po intravenózním podání přenáší vektor aav9 myší játra s vysokou účinností. Transdukované hepatocyty pak mohou exprimovat transgen a vylučovat proteinový produkt do systémového oběhu .

od 3 týdnů po injekci, jsme pozorovali významné zvýšení tělesné hmotnosti, které přetrvávaly po dobu soudu s AAV9-GDF11PRO-Fc (+ 7,7% na 12 týdnů; p = 0.0094) a AAV9-GDF11PRO-Fc D122A (+ 11% na 12 týdnů; p = 0.006) léčba (Obr. 4a). Je třeba poznamenat, že v důsledku dystrofické patologie myši mdx obvykle vykazují kompenzační svalovou hypertrofii, která může částečně maskovat zvýšení svalové hmoty vyvolané expresí GDF11PRO-Fc. Pokud jde o testy funkce svalů, ošetřené myši vykazovaly zvýšenou sílu úchopu přední končetiny, a to i po normalizaci na tělesnou hmotnost. Rozdíl v normalizované síle úchopu přední končetiny však dosáhl statistické významnosti pouze ve skupině AAV9-GDF11PRO-Fc D122A. Ve 12. týdnu po skončení léčby, průměrné normalizované přední grip síla byla zvýšena o + 28% (p = 0.0873) a + 36% (p = 0.0248) u myší léčených AAV9-GDF11PRO-Fc a AAV9-GDF11PRO-Fc D122A, respektive (Obr. 4b). Výkon rotarodu byl také zlepšen v průměru léčbou AAV9-GDF11PRO-Fc D122A (+93% zvýšení doby latence rotarodu; p = 0, 0127). Rotarod výkon byl také zlepšila v AAV9-GDF11PRO-Fc skupiny, ale tento rozdíl nedosáhl statistické významnosti (+ 44% nárůst v rotarod latenci; p = 0.2835; Obr. 4c). V žádné ze skupin nebyl pozorován žádný rozdíl v době běhu běžeckého pásu (obr. 4d).

br. 4

GDF11PRO-Fc zlepšuje přilnavost sílu a rotarod výkon v dystrofické mdx myší. 6-týden-staré mdx myši byly léčeny AAV9-GDF11PRO-Fc (n = 7), AAV9-GDF11PRO-Fc D122A (n = 7), nebo vozidlo (n = 7), přes ocasní žíly injekci. průměrná tělesná hmotnost v průběhu času. b síla úchopu přední končetiny se v průběhu času normalizovala na tělesnou hmotnost. c nejlepší doba do poklesu přípravku rotarod zaznamenaná před léčbou (výchozí hodnota) a 12 týdnů po léčbě. Pro analýzu byl použit nejlepší čas ze tří pokusů. d celková vzdálenost běhu na vytrvalostním testu běžeckého pásu od před léčbou (výchozí hodnota) a 12 týdnů po léčbě. Všechny chybové sloupce představují průměr ± SEM. *p < 0,05; **p < 0.01; n.s. není významná; ve srovnání s vozidlem zacházeno kontrolu

Na konci 12-týdenní studii, svalové hypertrofie byl naprosto patrný v léčených myší (Obr. 5a). Průměrná vlhké tkáně masy tibialis anterior, lýtkového, čtyřhlavého svalu byly zvýšeny o + 17% (p = 0.0472), + 20% (p = 0.0011), a + 14% (p = 0.0333), respektive ve skupině AAV9-GDF11PRO-Fc. V AAV9-GDF11PRO-Fc D122A skupiny, tyto hodnoty byly dále zvýšena na + 26% (p = 0.0030), + 31% (p = 0.0003), a + 23% (p = 0.0009) přes vozidla léčených ovládání pro změnu v průměru tibialis anterior hmoty, gastrocnemius hmoty, a čtyřhlavý sval hmoty, v tomto pořadí. Kromě toho, membrány mokré tkáně hmoty, byla zvýšena o + 19% (p = 0.0162) a + 26% (p = 0.0014) v AAV9-GDF11PRO-Fc a AAV9-GDF11PRO-Fc D122A skupin, respektive. Je zajímavé, že srdeční hmota nebyla léčbou významně změněna. Průměrná gastrocnemius myofiber průřezu plocha byla vyšší u myší léčených AAV9-GDF11PRO-Fc (+ 23%; p = 0.0226) a AAV9-GDF11PRO-Fc D122A (+ 25%; p = 0.0170; Obr. 5c a d). V MFD distribuční analýzy, MFD tendenci k vrcholu kolem 20-30 µm napříč všemi skupinami, což je pravděpodobně způsobeno vyšší podíl malých regenerační myofibers v dystrofických svalů. Nicméně, zacházení s AAV9-GDF11PRO-Fc a AAV9-GDF11PRO-Fc D122A udělal za následek zvýšený podíl myofibers multifunkční zařízení s vyšší než 64 µm, což naznačuje, že faktor projevu přiměl myofiber hypertrofie (Obr. 5e) v kosterním svalu.

br. 5

GDF11PRO-Fc indukuje kosterního svalstva hypertrofie v dystrofické mdx myší. 6-týden-staré mdx myši byly léčeny AAV9-GDF11PRO-Fc (n = 7), AAV9-GDF11PRO-Fc D122A (n = 7), nebo vozidlo (n = 7), přes ocasní žíly injekci. Myši byly utraceny 12 týdnů po léčbě. reprezentativní hrubé zadní svalstvo. b hmotnost mokré tkáně svalů končetin, bránice a srdce. c reprezentativní imunofluorescenční obrazy průřezů gastrocnemius obarvené WGA konjugovaným Alexafluorem-488 pro vizualizaci myofiber. Stupnice reprezentují 100 µm. d průměrná plocha průřezu myofiberu v gastrocnemius. e myofiber MFD distribuce v gastrocnemius. Na jednu myš bylo naměřeno minimálně 500 myofiberů. F identifikace GDF11PRO-Fc western blot v lyzátu jaterní tkáně a séru myší léčených AAV9-GDF11PRO-Fc. Stejné zatížení proteinem bylo ověřeno barvením Ponceau S a GAPDH byl použit jako Kontrola zatížení v lyzátech jaterní tkáně. *p < 0,05; **p < 0.01; ***p < 0.001; n.s. není významná; ve srovnání s vozidlem zacházeno kontrolu

Western blot analýza potvrdila, proteinové exprese transgenů v játrech a séru. Podle očekávání bylo pásmo při 58 kDa odpovídající plné délce GDF11PRO-Fc nebo GDF11PRO-Fc D122A detekovatelné u léčených myší. Sérové hladiny full-délka propeptid byl mírně vyšší u myší léčených AAV9-GDF11PRO-Fc D122A než u pacientů léčených s AAV9-GDF11PRO-Fc, což naznačuje, že sérové přetrvávání aktivní propeptid byl navýšen D122A mutace (Obr. 5f).

Celkově tyto výsledky ukazují, systémové výraz GDF11PRO-Fc a GDF11PRO-Fc D122A zvyšuje kosterní svalové hmoty v mdx dystrophic mice a že to kosterního svalstva hypertrofie je spojena s zlepšení úchopové síly a pohybové koordinace. Zdá se však, že léčba neovlivňuje svalovou vytrvalost na základě běžeckého výkonu běžeckého pásu. Navíc se zdálo, že mutant D122A je mírně účinnější při zvyšování svalové hmoty a funkce, pravděpodobně kvůli zlepšené perzistenci v séru.

Systémové GDF11PRO-Fc gen dodání nesnižuje dystrofické patologie u mdx myší

řada studií uvádí, že blokáda TGF-β-ActRII-SMAD2/3 signalizace, ať už MSTN inhibice nebo blokáda ActRII, může mít léčebný přínos na zvířecích modelech DMD . K určení dopadu léčby AAV9-GDF11PRO-Fc na dystrofickou patologii jsme provedli histologickou analýzu svalů končetin a bránice.

Charakteristické příznaky dystrofické patologie, včetně svalové nekrózy, centrální nukleace, intramuskulární ukládání kolagenu, a přítomnost zánětlivých infiltrátů byl patrný napříč všemi mdx skupin (Obr. 6a). U gastrocnemius bylo procento fibrotické oblasti sníženo o-39% (p = 0, 0273) u myší léčených AAV9-GDF11PRO-Fc. Fibróza ve skupině gastrocnemius byla také mírně snížena ve skupině AAV9-GDF11PRO-Fc D122A; vzhledem k vysoké intersubjektivní variabilitě intramuskulární fibrózy končetin však tento rozdíl nedosáhl statistické významnosti (- 28%; p = 0,1230; obr. 6b). Rovněž nebyl pozorován žádný významný rozdíl v podílu centrálně nukleovaných myofiber, což naznačuje, že regenerace myofiber se aktivně vyskytuje ve všech skupinách (obr. 6c). Sérum CK, marker rozpadu svalů, se také léčbou významně nezměnilo (obr. 6d). Navíc, lokalizované zhoršení integrity myofiberové membrány, měřeno anti-myším IgG imunofluorescenčním barvením, bylo patrné ve všech skupinách mdx. Nečekaně, mdx myší léčených AAV9-GDF11PRO-Fc D122A vykazoval mírné zvýšení IgG-pozitivní plocha na průměr, ale tento rozdíl nedosáhl statistické významnosti (+ 55%; p = 0.1729; Obr. 6e a f; další soubor 1: obrázek S5). Zjevné známky myofiber nekróza, regenerace, centrální nukleace a IgG penetrancí nebyly zjevné v divokého typu C57BL/10J gastrocnemius, což naznačuje, že tyto značky jsou specifické pro dystrofické patologie (Obr. 6a-f; další soubor 1: obrázek S5).

br. 6

GDF11PRO-Fc nesnižuje dystrofické patologie u mdx myší. 6-týden-staré mdx myši byly léčeny AAV9-GDF11PRO-Fc (n = 7), AAV9-GDF11PRO-Fc D122A (n = 7) nebo vozidlo (n = 7), přes ocasní žíly injekci. Jako kontrola divokého typu byly zahrnuty také myši odpovídající věku C57BL/10J (n = 5). Myši byly utraceny 12 týdnů po léčbě. reprezentativní barvení HE a MTC z průřezů gastrocnemius myší c57bl / 10J a mdx. Centrální nukleace je patrná ve všech skupinách mdx. Lokalizované oblasti myofiberové nekrózy a regenerace jsou označeny černou šipkou. Fibrotická oblast je reprezentována modrou oblastí na barvení MTC. Stupnice reprezentují 50 µm v sekcích HE a 100 µm v sekcích MTC. b fibrotická oblast v gastrocnemius vyjádřená jako procento z celkové plochy průřezu svalů. c procento myofiber vykazujících centrální nukleaci. D měření cirkulujících hladin CK v séru, což je marker poškození svalů. e reprezentativní imunofluorescenční obrazy barvení myší IgG (červené) v průřezech tkáně gastrocnemius. Pozitivní barvení IgG indikuje propustnost myofiber na sérové proteiny a ztrátu integrity membrány. Sekce byly společně obarveny WGA pro vizualizaci jednotlivých myofiberů. Zvětšená oblast je označena bílým rámečkem. Charakteristické IgG-pozitivní myofibery jsou zobrazeny bílou šipkou. Stupnice reprezentují 100 µm. f Plocha IgG-pozitivních myofiber vyjádřená jako procento z celkové plochy průřezu svalů. G reprezentativní barvení HE a MTC z membránových průřezů myší c57bl / 10J a mdx. Rozsáhlá patologie je patrná u mdx, ale ne u myší C57BL/10J. Stupnice reprezentují 100 µm. h fibrotická oblast v membráně vyjádřená jako procento z celkové plochy průřezu. *p < 0.05; ***p < 0.001; ****p < 0.0001; n.s. není významný; ve srovnání s vozidlem zacházeno mdx ovládací prvky

V bránici, H&E barvení odhalilo rozsáhlé nekrózy a intramuskulární ukládání kolagenu v obou léčených a neléčených mdx skupin (Obr. 6g). Podobné tomu, co bylo pozorováno v lýtkového svalu, zacházení s AAV9-GDF11PRO-Fc nebo AAV9-GDF11PRO-Fc D122A produkoval mírné snížení bránice intramuskulární fibróza celkově. Průměrné procento fibrotické plochy v membráně bylo sníženo o 15% (p = 0, 0328) a 17% (p = 0.019) s ošetřením AAV9-GDF11PRO-Fc a aav9-GDF11PRO-Fc D122A (obr. 6h). Jak se očekávalo, tyto patologické rysy do značné míry chyběly v membráně divokých myší typu C57BL/10J (obr. 6g a h). Z těchto údajů zjistíme, že GDF11PRO-Fc a GDF11PRO-Fc D122A jsou schopny mírně inhibovat intramuskulární ukládání kolagenu ve svalech končetin a bránici po dobu 3 měsíců. Nicméně, léčba se nezdá zastavení probíhající cyklus svalové degenerace a regenerace ve gastrocnemius nebo bránice dospělých mdx myší.