Absorpční spektra

absorpční spektrum thiaminu byla zaznamenána proti vodě (Obrázek 1), bylo zjištěno, že thiamin vykazuje maximální absorpci peak (λ max) při 235nm. Protože vysoce modrá-posunul λ max thiamin, jeho stanovení v lékové formě na základě přímé měření jeho absorpce pro ultrafialové záření je citlivé na potenciální rušení od běžných pomocných látek. Proto byla nepochybně nutná derivatizace thiaminu k dosažení viditelného rozsahu absorbujícího druhu. Tak byla provedena derivatizace thiaminu s NBD-Cl a absorpční spektrum produktu bylo zaznamenáno proti polotovaru činidla (Obrázek 1). Bylo zjištěno, že produkt je hnědé barvy vykazující λmax při 434nm a λmax NBD-Cl byl 342nm. Λmax derivátu thiaminu-NBD – Cl byl červeně posunut, což eliminovalo potenciální interferenci. Vlnová délka 434 nm byla proto stanovena jako optimální.

Optimalizace reakčních podmínek,

Obrázek 1: Absorpční spektra Thiamin (3), NBD-Cl (2) a komplexu mezi nimi (1).

optimální podmínky pro vyvinuté metody byly stanoveny různé parametry a zároveň zachování ostatních parametrů konstantní a následující efekt působící na absorbance barevného produktu. Za účelem stanovení experimentálních podmínek byl zkoumán účinek různých parametrů, jako je pH, čas, objem pufru a koncentrace NBD-Cl.

účinek pH

účinek pH na reakci mezi thiaminem a NBD-Cl byl testován změnou pH formy 7,0 až 12,0. Jak je znázorněno na obrázku 2, absorpce produktu je nízká při pH 7,0, což naznačuje, že thiamin nemůže reagovat s (NBD-Cl) v neutrálním prostředí. To bylo pravděpodobně způsobeno existencí aminoskupiny thiaminu ve formě hydrochloridové soli, která brání nukleofilní substituční schopnosti. Jak se pH zvýšilo ze 7 na 12, hodnoty se dramaticky zvýšily, uvolňovaly aminoskupinu thiaminu a usnadňovaly nukleofilní substituci. Maximální absorpce bylo dosaženo při hodnotě pH 10,5. Při hodnotách pH vyšších než 10, 5 došlo ke snížení absorpce. To bylo přičítáno pravděpodobně zvýšení množství hydroxidového iontu, které zvyšuje rychlost zpětné reakce thiaminu s NBD-Cl.

účinek reakční doby

absorbance reakčního produktu byla sledována v různých časech (obrázek 3). Zachování ostatních podmínek nedotčena, absorbance reakčního produktu byl následoval poté, co stála za jiné časové rozpětí při 25°C. výsledky ukazují, že thiamin reaguje s NBD-Cl při 25°C a absorbance začne postupně zvyšovat a dosáhnout maximální po 25min. Po delší reakční době byl pozorován mírný pokles absorbance. V souladu s tím byla stanovena 25min jako vhodná reakční doba pro stanovení.

Vliv množství vyrovnávací paměti

Obrázek 2: Vliv pH na reakci Thiamin s NBD-Cl.
thiamin (20 µg / ml): 1 ml, NBD-Cl conc. 0,2% (w / v), reakční doba 20 min.

Obrázek 3: Vliv doby reakce na reakci Thiamin s NBD-Cl.
thiamin (20 µg / ml): 1 ml, pufr (pH 10.5): 1,5 ml, NBD-Cl conc. 0,2% (HM.).

Udržování pH na 10,5, vliv množství tlumivého roztoku na absorbanci reakčního produktu byl také studován (viz Obrázek 4). Obrázek ukazuje, že absorbance reakčního produktu se rychle zvyšuje s nárůstem množství tlumivého roztoku, a stává maximální, když množství tlumivého roztoku dosahuje 1,5 mL. Proto bylo zvoleno množství 1,5 mL roztoku pufru, aby byla zajištěna nejvyšší absorbance.

účinek koncentrace NBD-Cl

studie účinku koncentrací NBD-Cl ukázala, že reakce byla závislá na koncentraci činidla. Nejvyšší intenzity absorpce bylo dosaženo při koncentraci NBD-Cl 0,2% (w / v) a vyšší koncentrace NBD-Cl vede ke snížení absorbance (obrázek 5).

z výše uvedených experimentů s nastavením parametrů byly optimalizované podmínky použité pro test: pH 10,5, koncentrace NBD-Cl 0,2% (w / v), objem pufru 1,5 mL, reakční doba 25min a teplota 25ºC.

Obrázek 4: Vliv Pufru množství (ml) na reakci Thiamin s NBD-Cl.
thiamin (20 µg / ml): 1 ml, pufr pH: 10,5, NBD-Cl conc. 0,2% (w / v), reakční doba 25 min.

Obrázek 5: Vliv NBD-Cl v koncentraci na jeho reakci s Thiaminu.
thiamin (20 µg / ml): 1 ml, pufr (pH 10,5): 1,5 ml, reakční doba 25 min.

validace metody

metoda byla validována pro následující parametry: specifičnost, linearita, přesnost, přesnost, mez detekce (LOD), mez kvantifikace (LOQ) a robustnost podle pokynů Mezinárodní konference o harmonizaci (ICH).

Linearita, mez detekce (LOD) limit kvantifikace (LOQ)

linearita byla hodnocena pomocí lineární regresní analýzy určena výstavbu sedmi koncentrace thiaminu, v rozmezí od 05–35µg/mL, která byla vypočtena pomocí nejmenších čtverců regrese metoda pro výpočet kalibrační rovnice a korelační koeficient. Kalibrační křivky byly konstruovány vykreslením koncentrace versus absorbance pomocí lineární regresní analýzy. Regresní rovnice pro výsledky byl=0.033 x – 0.009 (r2=0.999), kde A je absorbance na 434 nm, x je koncentrace thiaminu v µg/mL v rozmezí 05-35 µg/mL, a r je korelační koeficient (Tabulka 1). Bylo zjištěno, že rozsah lineárních koncentrací je srovnatelný s naší předchozí metodou používající NQS . Mez detekce (LOD) a mez kvantifikace (LOQ) byly stanoveny podle následujícího vzorce LOD=3.3×SDa / b a LOQ=10×SDa / b, SDa je směrodatná odchylka zachycení; b je sklon podle pokynů ICH . LOD a LOQ byly 0.667 a 2.020 µg/mL (Tabulka 1).

Správnost

přesnost navrhované metody byla provedena s použitím 3 různých koncentracích 10, 20 a 30 µg/mL thiamin léčiva v lineárním rozmezí vypočítá jako procento léku zotavil ze vzorků (Tabulka 2).

Relativní chyba (RE) byla v rámci 0.24% s odpovídající směrodatné odchylce v rámci 0.004 pro tři různé stanovení (Tabulka 3).

robustnost

reakční mechanismus: bylo hlášeno, že NBD-Cl reaguje s aminoskupinou primárních nebo sekundárních derivátů Aminu . Podobně, amino skupina thiaminu může působit jako nukleofil vzhledem k osamělé dvojice elektronů na atom dusíku, směřování k útoku na elektron–deficitní centrum v NBD-Cl (Tabulka 4 & Obrázek 6). Současně bylo prokázáno, že složení produktu je 1: 1 thiaminu a NBD-Cl (Obrázek 7). Dospělo se tedy k závěru, že aminoskupina thiaminu reaguje s NBD-Cl za vzniku hnědého aduktu. Reakční rovnice je znázorněna na obrázku 7.

obrázek 6: The Job’s method plot for the stoichiometry of the reaction of Thiamine with NBD-Cl Vr: Volume of NBD-Cl (7.5×10-4 mol/L), Vt: Volume of Thiamine (7.5×10-4 mol/L), Vr + Vt=10 ml.

Aplikace navrhované metody pro analýzu thiamin léková forma,

Thiamin tablety byly podrobeny analýze podle navrhované a označení nároku dobře souhlasí s naší novou metodou, jak je znázorněno v Tabulce 5. Navrhovaná metoda má tu výhodu, že je prakticky prostá rušení pomocnými látkami.

Figure 7: Reakce thiaminu s NBD-Cl ukazující stechiometrii 1: 1.